糖尿病性腎症における低血糖誘導ミトコンドリア由来活性酸素種の寄与解析

低血糖诱导的线粒体源性活性氧在糖尿病肾病中的贡献分析

基本信息

批准号：
22K15687
负责人：
梶原伸宏
金额：
$ 2.91万
依托单位：
Kumamoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

申請者らはこれまで高血糖による糖尿病合併症発症仮説として「ミトコンドリア由来活性酸素種 (mtROS) 過剰産生」説を提唱してきたが、低血糖下では脂肪酸の酸化亢進を介してmtROSが発生し、血管内皮障害を誘導することを世界で初めて見出した。引き続いて、低血糖誘導によるmtROSが、糖尿病モデルマウスにおいて糖尿病網膜症の発症・進展に関与することを証明した。本研究では、糸球体由来の血管内皮細胞を用いて、急激な血糖是正や低血糖により誘導されたmtROSが糖尿病腎症の増悪に関与する可能性を検討し、さらに同現象をモデルマウスで実証する。当該年度では、本研究におけるin vitroの実験として、ヒト腎糸球体毛細血管内皮細胞 (HGMECs) における高グルコース刺激によるmtROS産生を検討した。mtROSは還元型Mitotracker Redを用い共焦点レーザー顕微鏡により観察・検討を行った。また増加したROSがミトコンドリア由来であることの確認のため、adenoviral vectorを用いてミトコンドリア型スーパーオキシドジスムターゼであるMnSODを過剰発現 (Nature 2000) させたヒト腎糸球体毛細血管内皮細胞（HGMECs + MnSOD）を使用した。a) HGMECs; 正常グルコース濃度培養群 (NG群; 5.5 mM)、b) HGMECs; 高グルコース濃度培養群 (HG群; 25 mM) の2群による検討では、HG群はNG群に比してMitotracker Redの蛍光強度増加を認め、HG + MnSOD群ではその蛍光強度増加が抑制されていた。以上の結果から、大血管由来や網膜毛細血管由来の内皮細胞と同様に、高グルコース状態下の腎糸球体毛細血管内皮細胞においてもmtROSが増加することを確認した。

申请人之前提出了“线粒体源性活性氧（mtROS）过量产生”的理论，作为高血糖引起的糖尿病并发症的假设，但在低血糖下，mtROS是通过脂肪酸氧化增加而产生的。全球首次发现它会引起血管内皮损伤。随后，我们证明低血糖诱导的 mtROS 参与糖尿病模型小鼠糖尿病视网膜病变的发生和进展。在这项研究中，我们使用肾小球来源的血管内皮细胞来检查快速血糖校正或低血糖诱导的mtROS是否与糖尿病肾病的恶化有关，并在小鼠模型中进一步证明了这一现象。今年，作为本研究的体外实验，我们研究了高葡萄糖刺激诱导人肾小球毛细血管内皮细胞（HGMEC）产生mtROS。使用还原 Mitotracker Red 的共焦激光显微镜观察和研究 mtROS。此外，为了确认增加的ROS源自线粒体，我们使用腺病毒载体在人肾小球毛细血管内皮细胞（HGMEC + MnSOD）中过表达MnSOD，一种线粒体超氧化物歧化酶（Nature 2000）。在使用两组的调查中：a) HGMEC；正常葡萄糖浓度培养组（NG 组；5.5 mM）和 b) HGMEC；高葡萄糖浓度培养组（HG 组；25 mM），HG 组的 Mitotracker 浓度高于NG组中观察到红色荧光强度的增加，并且在HG+MnSOD组中这种荧光强度的增加被抑制。从以上结果，我们确认高糖条件下肾小球毛细血管内皮细胞以及源自大血管和视网膜毛细血管的内皮细胞中mtROS增加。