トロンボモジュリン結合障害型異常プロトロンビンによる血栓形成機構の分子学的解析

异常凝血酶原与血栓调节蛋白结合受损导致血栓形成机制的分子分析

基本信息

批准号：
22K15663
负责人：
長屋聡美
金额：
$ 3万
依托单位：
Kanazawa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度は、野生型（WT）および、アンチトロンビンとの結合親和性低下（ATR）およびトロンボモジュリンとの結合親和性低下（TMR）を示すと予測された変異型プロトロンビン（M380T、R431H、R596L）を作製した。プロトロンビンはNi-NTAを用いたHisタグ精製およびGla化プロトロンビンのみを精製するためバリウム吸着を行ない、CBB染色にて高純度のリコンビナントプロトロンビンを精製できていることを確認した。凝固時間法による活性測定では、WTは血漿由来ヒトプロトロンビンと同等の活性を有し、WTを100%とするとM380Tは9.0%、R431Hは37.7%、R596Lは44.5%であり、全ての変異体において出血傾向の性質を示した（p<0.0001）。トロンビン特異的な蛍光基質を用いたアミド分解活性測定法を確立し、WTを100%としたところ、M380Tは63.9%（p<0.0001）と有意に低下したが、R431Hは88.9%、R596Lは107.5%とWTと同等であった。ここまでの結果より、M380Tは出血傾向を呈することから、ATR・TMRの解析からは除外した。ウエスタンブロットで検出したトロンビンーAT複合体（TAT）形成量は、WTを100 %としたところR431Hは100 %であったが、R596Lは7.5 % しか形成されなかった（p<0.01）。さらに、合成基質法の測定系を用いて、AT存在下での残存トロンビン活性を測定した。WTおよびR431Hでは反応時間の経過に伴い残存トロンビン活性が低下した。一方で、R596Lでは残存トロンビン活性がほとんど低下せず、WTに比べ有意に高い残存トロンビン活性を維持していた。以上より、R431HはATRはほとんど有していないと考えられた。

今年，我们生产了野生型（WT）和突变凝血酶原（M380T，R431H，R596L），这些野生型（M380T，R431H，R596L）预测与抗凝结蛋白（ATR）的结合亲和力降低，并降低了与血栓瘤蛋白（TMR）的结合亲和力。将凝血酶原用于使用Ni-NTA的标签纯化，并仅纯化凝血酶素，并仅纯化凝血酶素，并且CBB染色证实可以纯化高纯度重组凝血酶蛋白。在使用加入时间方法的活动测量中，WT的活性等于血浆衍生的人凝血酶蛋白，100％WT的M380T为9.0％，R431H为37.7％，R596L为44.5％，表明所有在所有突变体中都有出血性蛋白质（P <0.00000101）。建立了一种使用凝血酶特异性荧光底物测量酰胺降解活性的方法，WT设置为100％，M380T显着降低至63.9％（P <0.0001），但R431H为88.9％，R596L为107.5％，这是107.5％，这是等效的。根据到目前为止的结果，M380T表现出出血的趋势，并被排除在ATR和TMR分析之外。 WT的蛋白质印迹形成的凝血酶AT复合物（TAT）的量为100％，而R431H为100％，R596L仅为7.5％（P <0.01）。此外，使用合成底物方法测量系统测量AT存在下的残留凝血酶活性。使用WT和R431H，残留的凝血酶活性随反应时间的通过而降低。另一方面，与WT相比，R596L的残留凝血酶活性几乎没有降低，残留凝血酶活性显着更高。基于上述，人们认为R431H几乎没有ATR。

项目成果

期刊论文数量（7）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

The potential of PS cleavage to regulate anticoagulant function in septic DIC

PS 裂解调节脓毒症 DIC 抗凝功能的潜力

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
Satomi Nagaya;Koichi Yamaguchi;Asaka Matsui;Tomohide Tsuda;Eriko Morishita
通讯作者：
Eriko Morishita

A case of venous thromboembolism caused by protein C deficiency due to a novel gene mutation

新型基因突变导致蛋白C缺乏导致静脉血栓栓塞1例

DOI：
10.1016/j.jccase.2022.07.012
发表时间：
2022
期刊：
Journal of Cardiology Cases
影响因子：
0
作者：
Noiri Jun-ichi;Matsuzoe Hiroki;Nagaya Satomi;Nishio Ryo;Matsumoto Daisuke;Takaishi Hiroshi;Morishita Eriko
通讯作者：
Morishita Eriko

Molecular characterization of a novel splicing mutation of the PROS1 gene causing inherited protein S deficiency

导致遗传性蛋白 S 缺陷的 PROS1 基因新型剪接突变的分子特征

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
Tomoki Togashi;Satomi Nagaya;Makiko Meguro-Horike;Yuta Imai;Yuka Makita;Kensho Omori;Shin-Ichi Horike;Eriko Morishita
通讯作者：
Eriko Morishita

Effects of sample processing on antithrombin and protein C activity

样品处理对抗凝血酶和蛋白 C 活性的影响

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
Satomi Nagaya;Koichi Yamaguchi;Eriko Morishita
通讯作者：
Eriko Morishita

Identification and functional analysis of three novel genetic variants resulting in premature termination codons in three unrelated patients with hereditary antithrombin deficiency

导致三名无关的遗传性抗凝血酶缺乏症患者过早终止密码子的三种新遗传变异的鉴定和功能分析

DOI：
10.1007/s12185-022-03509-3
发表时间：
2022
期刊：
International Journal of Hematology
影响因子：
2.1
作者：
Imai Yuta;Nagaya Satomi;Araiso Yuhei;Meguro-Horike Makiko;Togashi Tomoki;Ohmori Kensho;Makita Yuka;Sato Eiichi;Yujiri Toshiaki;Nagamori Yuta;Horike Shin-ichi;Watanabe Atsushi;Morishita Eriko
通讯作者：
Morishita Eriko