熱帯熱マラリア原虫の蚊体内及びヒト肝細胞内における脂質代謝機構の解明

阐明恶性疟原虫蚊子和人肝细胞的脂质代谢机制

• 批准号: 22K15452
• 负责人: 宮崎 幸子
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Nagasaki University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2026-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15452/
• 关键词: 熱帯熱マラリア原虫; 脂質代謝; 肝内期; 遺伝子改変; マラリア原虫; ハマダラカ

本研究の目的は、熱帯熱マラリア原虫(Pf)が蚊体内やヒトの肝細胞内で発育するために必要なリン脂質生合成酵素を新たに同定し、Pfの生存・増殖に必須なリン脂質生合成系の分子基盤を明らかにすることである。これまでに赤内期のPfを対象とした研究により、リン脂質生合成酵素として複数の分子が同定されている。そこで本研究では、遺伝子改変Pfとハマダラカを用いたPf感染実験により、今まで未解明であった蚊のステージや肝内期の発育に必須なリン脂質生合成分子を明らかにする。遺伝子改変には、rapamycin-inducible Cre recombinase (DiCre) を発現するPfを用い、その標的遺伝子座にDiCre認識配列を挿入し、ラパマイシン処理によりDiCreを活性化することで標的部位が切断されるコンディショナルノックアウト(cKO)システムを利用する。2022年度は、標的リン脂質生合成分子のcKO原虫の作出、およびハマダラカを用いたPf感染実験系の立ち上げを行った。標的遺伝子にDiCre認識配列を導入するためのプラスミドをDiCre発現原虫にトランスフェクションし、薬剤選択を行った。PCRにより、得られた遺伝子改変原虫のゲノム上の標的部位にDiCre認識配列が導入されていることを確認した。しかし、この遺伝子改変原虫は薬剤選択の過程でDiCreの発現が消失しており、ラパマイシンによるcKOシステムが機能しないことが明らかとなった。その後、共同研究者により、改めてトランスフェクション及び薬剤選択が行われ、標的リン脂質生合成分子のcKO原虫が複数作出された。その遺伝子改変原虫はcKOシステムが機能していることが確認でき、赤内期における表現型解析が行われた。一方で、フランス・パスツール研究所からPf感染効率の高いハマダラカが分与され、当研究所内で飼育の安定化を行った。

这项研究的目的是新鉴定蚊子和人肝细胞中恶性疟原虫（PF）开发所需的磷脂生物合成酶，并阐明磷脂生物合成系统的分子基础，这对于生存和衍生物的生存至关重要。到目前为止，通过在红相期间对PF的研究，多个分子已被鉴定为磷脂生物合成酶。因此，在这项研究中，我们将揭示磷脂生物合成分子，这些分子对于蚊期和肝内阶段至关重要，直到现在，通过使用遗传修饰的PF和Anemone进行PF感染的实验，这些分子尚未被理解。为了进行遗传修饰，使用有条件的敲除（CKO）系统，其中将表达雷帕霉素诱导的CRE重组酶（DICRE）的PF插入到目标基因座中，并且通过雷帕霉素治疗激活DICRE，靶位点被裂解。在2022财年，我们生产了靶磷脂生物合成分子CKO原生动物，并使用海葵发起了PF感染实验。将DICRE识别序列引入靶基因的质粒被转染到表达DICRE的原生动物中，并进行了药物选择。 PCR证实，将DICRE识别序列引入了遗传修饰原生动物的基因组上的目标位点。然而，已经揭示了在这种转基因原生动物的药物选择过程中DICRE的表达消失，并且雷帕霉素诱导的CKO系统不起作用。随后，进行了合作者进行了更新的转染和药物选择，并产生了多种靶磷脂生物合成分子CKO原生动物。已经证实，CKO系统对基因修饰的原生动物的作用，在红相期间进行了表型分析。同时，法国巴斯德研究所（Pasteur Institute）分发了一种海葵，其PF感染效率很高，并且在我们的实验室内稳定了繁殖。