In situ observation of intracellular RAS activation and elucidation of its structural basis by in-cell NMR

通过细胞内 NMR 原位观察细胞内 RAS 激活并阐明其结构基础

• 批准号: 22K15068
• 负责人: 趙 慶慈
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Chiba University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15068/
• 关键词: in-cell NMR; 核磁気共鳴法; 翻訳後修飾; シグナル伝達; 低分子量GTPase

RASタンパク質は細胞内で翻訳後、脂質修飾により細胞膜に局在することで、細胞外刺激に応じて細胞増殖などに関わるシグナル伝達経路を活性化する分子スイッチであり、がん創薬の重要な標的分子である。本研究ではin-cell NMR法(細胞内NMR法)を用いて生きた細胞膜上に局在したRASの構造状態をリアルタイムで解析することにより上流刺激によるRASの活性化を定量的に捉えるとともに、RASの活性化に関与する細胞内の相互作用を明らかにすることを目指す。本年度は脂質修飾に必要なC末端部を含む全長RAS(KRAS4B)を大腸菌発現系で調製し、調製したRASが脂質修飾酵素FTaseによって脂質修飾が進行することを質量分析によって確認した。次にGFPと融合させたRASを調製し、SLO法によって細胞内に導入すると、脂質修飾部位(C185)依存的に細胞膜へ経時的に局在していくことが共焦点レーザー顕微鏡によって観測した。次に安定同位体標識RASをSLO法により細胞内に導入してNMRサンプル管に封入後バイオリアクターシステムにより培地を灌流しながらin-cell NMR測定により細胞内RASのNMRスペクトルを連続的に取得した。その結果、細胞内RASのIle由来のNMRシグナル強度が測定直後から経時的な減少を示し、細胞内に導入したRASが内在性の脂質修飾酵素によってを修飾を受けることによって細胞膜との相互作用が経時的に増大していることが示唆された。今後は、フッ素原子の導入やパルスシーケンスの改良などよりシグナル感度を向上することでin-cell NMR測定の時間分解能の向上させることを検討するとともに、RAS活性型割合の経時変化からシグナル伝達を介したRASの活性化の観測、各種シグナル伝達阻害剤の効果を定量的に評価する手法の確立を目指す。

RAS蛋白是分子开关，可通过在细胞内通过脂质修饰在细胞内翻译后将其定位在细胞膜中，激活与细胞增殖有关的信号传导途径，以及其他因素，对细胞外刺激进行响应，并且是癌症药物发现的重要靶标分子。在这项研究中，我们旨在通过使用细胞内NMR（细胞内NMR）分析局部在活细胞膜上的RA的结构状态来定量捕获RAS的激活，并阐明参与RAS活化的细胞内相互作用。在今年，包含脂质修饰所需的C末端的全长RAS（KRAS4B）是在大肠杆菌表达系统中制备的，并且通过质谱法证实，脂质修饰通过脂质修饰酶FTase在准备好的RAS中进行。接下来，准备与GFP融合的RAS通过SLO方法制备并引入细胞，并通过共聚焦激光显微镜观察到它在脂质修饰位点（C185）随时间播放到细胞膜。接下来，通过SLO方法将稳定的同位素标记的RAS引入细胞，封装在NMR样品管中，然后通过使用生物反应器系统灌注培养基，在灌注培养基的同时，连续获得细胞内Ras的NMR光谱。结果表明，随着时间的流逝，来自ILE衍生的NMR NMR信号的NMR信号强度随着测量的时间而降低，这表明引入到细胞中的RA会通过内源性脂质降解酶进行修饰，从而增加与细胞与细胞膜的相互作用的相互作用。将来，我们将考虑通过引入氟原子和改善脉冲序列来改善信号灵敏度的时间分辨率，我们还将旨在建立一种定量评估RAS活动类型的时间变化的各种信号传递抑制剂的影响的方法。

项目成果

In-cell NMR法を用いた動的構造解析によるRac1の細胞内活性制御機構の解明

利用细胞内NMR方法进行动态结构分析，阐明Rac1的细胞内活性调节机制

• 发表时间: 2023
• 作者: Keiji Cho (Qingci Zhao);Katsuhiro Donai;Wataru Kobayashi;Yuki Toyama; Takumi Ueda;Koh Takeuchi;Ichio Shimada;Noritaka Nishida
• 通讯作者: Noritaka Nishida

Real-Time In-Cell NMR Reveals the Intracellular Modulation of GTP-Bound Levels of RAS

• DOI: 10.1016/j.celrep.2020.108074
• 发表时间: 2020-08-25
• 期刊: CELL REPORTS
• 影响因子: 8.8
• 作者: Zhao, Qingci;Fujimiya, Ryu;Nishida, Noritaka
• 通讯作者: Nishida, Noritaka