RNAの酸化損傷ダイナミズムが制御するゼブラフィッシュ初期発生メカニズムの解明

阐明RNA氧化损伤动态控制的早期斑马鱼发育机制

• 批准号: 22K15042
• 负责人: 石橋 幸大
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: Kyoto Sangyo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15042/
• 关键词: ゼブラフィッシュ; 初期発生; RNA; 酸化ストレス; 胚発生

ゼブラフィッシュの初期発生過程において、活性酸素の一種である過酸化水素の細胞ないレベルと分布は発生段階や細胞群ごとにダイナミックに変化しており、これによって生じるRNAの酸化とトランスクリプトームの変化が密接にリンクしていると考えられる。まずは酸化損傷の生じたRNAを網羅的に同定するために、ゼブラフィッシュ胚からRNAを抽出したのち抗8-oxoG抗体を用いたRNA免疫沈降によって酸化損傷RNAを精製した。ポジティブコントロールとして、過酸化水素処理をしたゼブラフィッシュ胚からもRNAを抽出し同様の精製をおこなった。次世代シークエンスに供する前にRNAのクオリティコントロールをノザンブロッティングやRT-qPCRで行なったところ、酸化損傷に非特異的なRNAも大量に精製されていることが判明した。後の検討で、抽出したトータルRNAをそのまま免疫沈降に用いたことによるリボソームRNAのコンタミが問題であり、リボソームRNAの除去とRNAの断片化ののちに免疫沈降による精製をおこなう必要があると判明した。現在は改良したプロトコルによるRNAの精製と次世代シークエンスのライブラリ調整をおこなっている。次世代シークエンスが遅れており内在のmRNAを用いた評価はおこなえていないが、蛍光タンパク質をコードするレポーターmRNAに酸化損傷を施し、ゼブラフィッシュ胚へのインジェクション実験をおこなった。その結果、翻訳開始因子eIF2alphaのリン酸化に端を発する統合ストレス応答や、MAPキナーゼp38のリン酸化によるストレス応答が惹起されることがわかった。各々のタンパク質のリン酸化の程度は、mRNAの酸化損傷の程度に応じて大きくなることも見出した。

在斑马鱼的早期发育过程中，过氧化氢（一种活性氧）的细胞水平和分布根据发育阶段和细胞群而动态变化，这与RNA氧化和转录组的变化密切相关。已链接。首先，为了全面鉴定氧化损伤的RNA，我们从斑马鱼胚胎中提取RNA，并使用抗8-oxoG抗体通过RNA免疫沉淀纯化氧化损伤的RNA。作为阳性对照，从用过氧化氢处理的斑马鱼胚胎中提取RNA并以相同的方式纯化。当在进行二代测序之前使用Northern印迹和RT-qPCR对RNA进行质量控制时，发现大量非氧化损伤特异性的RNA也被纯化。后来的研究表明，由于使用提取的总RNA进行免疫沉淀，因此存在核糖体RNA污染的问题，并且需要在去除核糖体RNA并将RNA片段化后通过免疫沉淀进行纯化。目前，我们正在使用改进的方案纯化 RNA，并为下一代测序准备文库。尽管由于下一代测序的延迟而无法使用内源 mRNA 进行评估，但我们通过对编码荧光蛋白的报告基因 mRNA 进行氧化损伤，对斑马鱼胚胎进行了注射实验。结果表明，诱导了翻译起始因子eIF2α磷酸化引发的综合应激反应和MAP激酶p38磷酸化引发的应激反应。我们还发现，每种蛋白质的磷酸化程度随着 mRNA 氧化损伤的程度而增加。