セラミド非小胞輸送に関与する新規タンパク質の同定と機能解明

参与神经酰胺非囊泡运输的新型蛋白质的鉴定和功能阐明

基本信息

批准号：
22K14863
负责人：
池田敦子
金额：
$ 3万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K14863/
关键词：
酵母 Tricalbin セラミド非小胞輸送脂質ホメオスタシス

项目摘要

細胞内セラミドの量はオルガネラ間輸送によってコントロールされている。小胞体からゴルジ体へのセラミド輸送には、小胞輸送に加えて非小胞輸送が存在する。これまでの解析から私たちは、真核細胞で保存された小胞体膜タンパク質であるTricalbin (Tcb1, 2, 3) が、セラミドの非小胞輸送に必要であることを発見した。しかしながら、Tricalbinの機能がどのように制御されているか、他にはどのようなタンパク質が関与しているのかなど、セラミド非小胞輸送機構の全貌は未だ謎に包まれている。そこで本研究は、セラミド非小胞輸送に関与する候補タンパクのリストアップと機能同定を目指す。この目的を達成するために本年度は、Tcb3タンパク質と相互作用するタンパク質の同定を試みた。研究実績の概要は、以下の3点である。(1)Tcb3ドメインと相互作用する細胞質タンパク質の同定：GFPタグを融合したTcb3の細胞質ドメインを用いて、抗GFP抗体を用いた免疫沈降法によって結合タンパク質を精製し、質量分析によって同定を行った。 (2) Tcb3と相互作用する膜タンパク質の同定：当初は技術的に困難であると予想されたことから、細胞質タンパク質のみを対象として解析する予定であった。しかし、実験手法を洗練したことにより、膜タンパク質の精製および同定に成功した。(3)同定されたタンパク質とTcb3の結合について、免疫沈降法およびウエスタンブロッティングによって検証を行い、候補となるタンパク質をリストアップした。

细胞内神经酰胺的量由细胞器间运输控制。除了囊泡运输之外，神经酰胺从内质网运输到高尔基体还存在非囊泡运输。根据我们之前的分析，我们发现 Tricalbin (Tcb1,2,3) 是真核细胞中保守的内质网膜蛋白，是神经酰胺的非囊泡运输所必需的。然而，神经酰胺非囊泡运输的整个机制仍然笼罩在神秘之中，包括三卡宾的功能是如何调节的以及还有哪些其他蛋白质参与其中。因此，本研究旨在列出并鉴定参与神经酰胺非囊泡运输的候选蛋白的功能。为了实现这一目标，今年我们尝试鉴定与 Tcb3 蛋白相互作用的蛋白。研究结果概括为以下三点。 (1)与Tcb3结构域相互作用的细胞质蛋白的鉴定：使用与GFP标签融合的Tcb3的细胞质结构域，使用抗GFP抗体通过免疫沉淀纯化结合蛋白，并通过质谱法进行鉴定。 (2)与Tcb3相互作用的膜蛋白的鉴定：最初预计这在技术上会很困难，因此我们计划仅分析细胞质蛋白。然而，通过改进实验方法，他们能够成功纯化和鉴定膜蛋白。 (3)通过免疫沉淀和Western blotting验证鉴定蛋白与Tcb3的结合，并列出候选蛋白。