sRNAが支配する大腸菌の胃酸耐性制御メカニズムの解明とその感染防除法への応用

sRNA控制大肠杆菌胃酸抵抗控制机制的阐明及其在感染控制方法中的应用

基本信息

批准号：
22K14809
负责人：
神田健
金额：
$ 2.91万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

2022年度の研究成果は、主に以下の2点である。①GcvB sRNAが大腸菌の芳香族アミノ酸代謝を制御する分子メカニズムの解明まず、芳香族アミノ酸（Phe、Tyr、Trp）の生合成酵素およびトランスポーターをコードする全ての遺伝子（制御が既知のものを除いて20遺伝子）に対してin silico解析を実施し、GcvBとの塩基対形成領域を予想した。次に、この予想領域周辺をgfp遺伝子に融合しレポーターアッセイを行ったところ、GcvBの高発現により14遺伝子の翻訳レベルが変化した。さらにこれらから生理的なターゲットを絞り込むため、GcvBをアラビノース誘導性プロモーターから短時間（10分間）発現させ、各遺伝子のRNAレベルの変化をRT-qPCRにより定量した。その結果、生合成酵素であるAroG、PheA、TrpC、さらにトランスポーターであるPhePをコードするmRNAは、GcvB発現により有意に減少した。以上の結果より、これら4遺伝子はGcvBが塩基対形成することで翻訳が抑制され、かつRNAが不安定化される新規ターゲットであると考えられる。②GcvB sRNAによる芳香族アミノ酸代謝の制御がもたらす増殖への影響の解析最小培地を用いて培養実験を行ったところ、ベクターコントロールでは芳香族アミノ酸添加に伴い増殖が増大したが、GcvB高発現株ではそのような増大は見られなかった。また、タンパク質構成アミノ酸20種から芳香族アミノ酸を除いた17種のみを添加した最小培地では、ベクターコントロールと比較して、GcvB高発現株の増殖に遅延が見られた。これらの現象は、GcvBが芳香族アミノ酸のトランスポーターおよび生合成酵素の翻訳を抑制することで生じたと考えることができ、①で解明した分子生物学的知見に一致した。

2022年的研究成果主要有以下两点。 ① 阐明GcvB sRNA控制大肠杆菌芳香族氨基酸代谢的分子机制，对20个基因进行了计算机分析，并预测了与GcvB的碱基配对区域。接下来，当我们将该预测区域周围的区域与 gfp 基因融合并进行报告基因检测时，我们发现由于 GcvB 的高表达，14 个基因的翻译水平发生了变化。为了进一步缩小这些生理目标的范围，GcvB 从阿拉伯糖诱导型启动子中表达一小段时间（10 分钟），并通过 RT-qPCR 量化每个基因 RNA 水平的变化。结果，编码生物合成酶 AroG、PheA 和 TrpC 以及转运蛋白 PheP 的 mRNA 因 GcvB 表达而显着减少。基于以上结果，这四个基因被认为是新的靶标，其翻译被抑制并且RNA通过与GcvB的碱基配对而不稳定。 ②GcvB sRNA控制芳香族氨基酸代谢对生长的影响分析当使用基本培养基进行培养实验时，载体对照中添加芳香族氨基酸后生长增加，但GcvB高表达菌株的生长增加没有观察到这种增加。此外，在仅含有除芳香族氨基酸之外的20种蛋白质构成氨基酸中的17种的基本培养基中，与载体对照相比，观察到GcvB高表达株的生长延迟。这些现象可以认为是GcvB抑制芳香族氨基酸转运蛋白和生物合成酶的翻译引起的，与①中阐明的分子生物学发现一致。