光触媒を用いたmRNAピンポイント光修飾法の開発と鎖間光架橋反応の解析

利用光催化剂开发mRNA精确光修饰方法并分析链间光交联反应

基本信息

批准号：
22K14792
负责人：
山野雄平
金额：
$ 2.91万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K14792/
关键词：
DNA RNA 光触媒ラベル化光損傷光反応 APサイト架橋反応 mRNA 機能性核酸核酸損傷

项目摘要

本研究では 1．mRNAをピンポイントで光修飾する新手法の開発、および、2．光触媒反応下における鎖間架橋型の核酸損傷の機構解明を目指した。1．本年度は、配列末端に鎖状（C6）リンカーを介して光触媒を導入したプローブDNA配列を設計・合成し、モデル標的配列（DNAあるいはRNA）と二重鎖形成させた。この二重鎖に対してラベル化試薬存在下で光を照射すると、光触媒近傍の核酸塩基やラベル化試薬から光触媒に電子が移動し、生じた活性種同士がラジカル反応を起こすことで配列選択的なラベル化を達成できると期待した。実際に、光照射後の反応産物を変性PAGEやMALDI-TOF-MSで解析した結果、本設計を利用した核酸のラベル化が可能であることが確認された。さらに、光触媒にATTO465、ラベル化試薬として特定のウラゾール系化合物を用いた場合には、配列選択的なラベル化も可能であることが示唆された。しかし、プローブDNAと二重鎖形成しない非標的配列もわずかに修飾されてしまうことがわかった。つまり、本設計をmRNAのような長鎖核酸の位置選択的なラベル化に適応しようと考えた場合には、選択性が不十分である（設計のさらなる改良が必要である）ことが示唆された。2．予備実験で得た知見をもとに数種の自己相補的なDNAとRNAをモデル配列として選び、それぞれに光触媒存在下で光を照射した。その結果、興味深いことに、グアニンとシトシンに富んだ特定のDNA配列を用いた場合にのみ、グアニンの脱塩基反応（APサイトの生成）が効率的に起きることが明らかとなった。さらに、光照射時間を変えて反応産物を変性PAGEで解析した結果、APサイトは過渡的な架橋（中間）体を経て生じている可能性があることが示された。しかし、架橋体の具体的な化学構造やAPサイト生成のメカニズムは、十分には解明できておらず、更なる検証が必要であると考えている。

在本研究中，1.开发一种用于 mRNA 精确光修饰的新方法，以及 2。我们的目的是阐明光催化反应过程中链间交联核酸损伤的机制。 1.今年，我们设计并合成了探针DNA序列，通过链（C6）接头在序列末端引入光催化剂，并与模型目标序列（DNA或RNA）形成双链。当该双链在标记试剂存在的情况下受到光照射时，电子从光催化剂和标记试剂附近的核碱基转移到光催化剂，所得的活性物质发生自由基反应，从而产生序列选择性。我们将能够实现准确的标签。事实上，通过变性PAGE和MALDI-TOF-MS分析光照射后的反应产物，证实可以使用该设计来标记核酸。此外，有人提出，当使用ATTO465作为光催化剂并且使用特定的乌唑基化合物作为标记试剂时，序列选择性标记也是可能的。然而，发现不与探针DNA形成双链体的非靶序列也被轻微修饰。换句话说，当将该设计应用于mRNA等长链核酸的位置选择性标记时，表明选择性不足（需要进一步改进设计）。 2.根据初步实验获得的知识，选择几种自互补DNA和RNA作为模型序列，并在光催化剂存在下对每种序列进行光照射。有趣的是，结果表明只有当使用富含鸟嘌呤和胞嘧啶的特定DNA序列时，鸟嘌呤的脱碱基反应（AP位点的产生）才能有效地发生。此外，通过改变光照射时间使PAGE变性来分析反应产物的结果表明，AP位点可能是通过瞬时交联（中间）形式产生的。然而，交联产物的具体化学结构和AP位点的生成机制尚未完全阐明，我们认为需要进一步验证。