光触媒を用いたmRNAピンポイント光修飾法の開発と鎖間光架橋反応の解析

利用光催化剂开发mRNA精确光修饰方法并分析链间光交联反应

基本信息

批准号：
22K14792
负责人：
山野雄平
金额：
$ 2.91万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K14792/
关键词：
DNA RNA 光触媒ラベル化光損傷光反応 APサイト架橋反応 mRNA 機能性核酸核酸損傷

项目摘要

本研究では 1．mRNAをピンポイントで光修飾する新手法の開発、および、2．光触媒反応下における鎖間架橋型の核酸損傷の機構解明を目指した。1．本年度は、配列末端に鎖状（C6）リンカーを介して光触媒を導入したプローブDNA配列を設計・合成し、モデル標的配列（DNAあるいはRNA）と二重鎖形成させた。この二重鎖に対してラベル化試薬存在下で光を照射すると、光触媒近傍の核酸塩基やラベル化試薬から光触媒に電子が移動し、生じた活性種同士がラジカル反応を起こすことで配列選択的なラベル化を達成できると期待した。実際に、光照射後の反応産物を変性PAGEやMALDI-TOF-MSで解析した結果、本設計を利用した核酸のラベル化が可能であることが確認された。さらに、光触媒にATTO465、ラベル化試薬として特定のウラゾール系化合物を用いた場合には、配列選択的なラベル化も可能であることが示唆された。しかし、プローブDNAと二重鎖形成しない非標的配列もわずかに修飾されてしまうことがわかった。つまり、本設計をmRNAのような長鎖核酸の位置選択的なラベル化に適応しようと考えた場合には、選択性が不十分である（設計のさらなる改良が必要である）ことが示唆された。2．予備実験で得た知見をもとに数種の自己相補的なDNAとRNAをモデル配列として選び、それぞれに光触媒存在下で光を照射した。その結果、興味深いことに、グアニンとシトシンに富んだ特定のDNA配列を用いた場合にのみ、グアニンの脱塩基反応（APサイトの生成）が効率的に起きることが明らかとなった。さらに、光照射時間を変えて反応産物を変性PAGEで解析した結果、APサイトは過渡的な架橋（中間）体を経て生じている可能性があることが示された。しかし、架橋体の具体的な化学構造やAPサイト生成のメカニズムは、十分には解明できておらず、更なる検証が必要であると考えている。

在这项研究中，1。开发一种用于查明光剂量mRNA的新方法，以及2。我们旨在阐明在光催化反应下链间交联的核酸损伤的机制。 1。今年，我们设计并合成了探针DNA序列，其中通过序列末端的链（C6）接头引入光催化剂，并与模型靶序列（DNA或RNA）形成双链。当在标记试剂的存在下将该双链用光照射时，电子将从光催化剂附近的核碱基和标记试剂转移到光催化剂，而所得的活性物种经历了自由基反应，从而导致实现序列选择性标记。实际上，在光照射之后，使用Denaturing Page或Maldi-Tof-MS分析了反应产物，并证实使用该设计的核酸标记是可能的。此外，已经提出，当将ATTO465用作光催化剂时，序列选择性标记是可能的，并且将基于特定的乌拉唑基化合物用作标记试剂。但是，发现不形成与探针DNA的双链的非目标序列也会稍作修改。换句话说，在考虑将这种设计适应长链核酸（例如mRNA）的位置标记时，建议选择性不足（需要进一步改善设计）。 2。基于初步实验中获得的发现，选择了几种类型的自相互DNA和RNA作为模型序列，并在存在光催化剂的情况下用光照射。有趣的是，只有当使用富含鸟嘌呤和胞嘧啶的特定DNA序列时，鸟嘌呤（生成AP位点）的无碱反应才有效。此外，使用变性页在不同时间的光照射时间对反应产物进行分析表明，AP位点可能通过瞬时交联（中间）发生。但是，交联体的特定化学结构和产生AP位点的机制尚未完全理解，需要进一步验证。