高度マルチプレックスSELEX法による機能性分子の限定的創製戦略の構築

使用先进的多重SELEX方法构建功能分子的有限创造策略

• 批准号: 22K14789
• 负责人: 天野 亮
• 金额: $ 3万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K14789/
• 关键词: RNAアプタマー; マルチプレックスSELEX; インスリン受容体; トランスフェリン受容体; 脳内薬剤送達用キャリア

創薬シーズの探索力の強化・高度化は、あらゆる疾患や生命現象の制御（創薬）と理解の深化（学術）に必須である。本課題では、RNAアプタマー特有の柔軟な創製法「SELEX法」を基盤とし、これまで困難であった「結合部位の限定化」と創薬（前臨床）に必須である「マウス/ヒト交差性（種差の壁）を克服する技術を、複数の標的分子を組み合わせた「マルチプレックスSELEX法」の構築によって実現することを目指す。本年度はまず、組換えマウス・ヒトトランスフェリン受容体（TfR）とインスリン受容体（IR）単体および内在性リガンドとの複合体を3種類の選抜材料を組合せて用いることで、結合部位を「マウス/ヒト共通部位かつ非リガンド結合部位」に限定化したSELEX実験および表面プラズモン共鳴（SPR）法による候補配列の機能評価を行った。約9回程度の選抜と増幅操作を繰り返した後、濃縮ライブラリーをハイスループットシーケンサーで解析、得られた膨大な配列情報から、アプタマー配列解析用プログラムFASTAptamer（doi: 10.1038/mtna.2015.4.）を用いて、候補配列を抽出した。次に、SPR解析によって、候補配列の結合標的の同定、結合親和性（解離定数 Kd）の算出およびマウス/ヒト交差性、内在性リガンドとの競合阻害性の評価を実施した。その結果、内在性リガンドとの非競合性を示す抗TfRアプタマー（Kd : 48 pM）とマウス/ヒト交差性を示す抗IRアプタマー（Kd : 0.044 pM）を単一のSELEX実験にて一挙に取得できた。このように本年度では、目標達成のためのマルチプレックスSELEX法およびSPR法による機能評価系の構築を完了し、さらに、当該技術の活用によって、マウス/ヒト交差性と内在性リガンドとの非競合性を示すアプタマー分子それぞれの取得に成功した。

加强和提高药物发现种子的搜索能力对于控制（药物发现）和加深理解（学术）所有疾病和生命现象至关重要。 Based on the flexible creation method unique to RNA aptamers, the SELEX method aims to realize the previously difficult "limiting binding sites" and the "mouse/human crossover (the barrier of species difference), by constructing a "multiplex SELEX method" that combines multiple target molecules. This year, we first used three types of selectable materials to combine three types of selectable materials, and to limit the binding site to a "mouse/human common site and non-ligand binding站点，“使用表面等离子体共振（SPR）方法对候选序列进行了功能评估。在重复大约九次的选择和放大操作后，使用高通量测序仪分析了富集的库，并使用program fastapatmer（doi：10.1038/mimmmm.2015 forpecter forked forked of forked forked of forked of forked of drogence forked forked获得的信息）提取候选序列。鉴定了SPR分析，候选序列的结合靶标，计算结合亲和力（离解常数KD），并评估了用内源性配体的鼠/人类交叉抑制和竞争性抑制。结果，在一个SELEX实验中，获得了抗TFR适体（KD：48 PM），显示出具有内源性配体和抗IR适体（KD：0.044 pm）的非竞争力（KD：0.044 PM）。因此，在今年，我们使用多重SELEX和SPR方法完成了功能评估系统的构建，以实现我们的目标，并利用技术，成功地获得了在小鼠/人类交叉兼容和内源性配体之间表现出非竞争力的适体分子。

项目成果

Multi-VLP SELEXとin silico解析によるデングウイルス中和アプタマーの創製戦略

使用 Multi-VLP SELEX 和计算机分析创建登革热病毒中和适体的策略

• 发表时间: 2022
• 作者: 天野亮;道下 瑛陽;中野 涼太,一ノ瀬顕子;浜田道昭;中村義一;高橋理貴
• 通讯作者: 高橋理貴