３次元組織培養モデルによるコラーゲンライブイメージングを用いた肝線維化機構の解析

使用 3D 组织培养模型利用胶原实时成像分析肝纤维化机制

基本信息

批准号：
21K18051
负责人：
守矢恒司
金额：
$ 3万
依托单位：
Tokyo Institute of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本研究では、所属グループで開発された「可視化I型プロコラーゲン発現システム」を利用した3次元肝臓組織培養モデルを構築し、コラーゲン分子の視点から肝線維化発症機構を解明することを目的としている。肝臓内での持続的な炎症反応により静止期の肝星細胞が活性化することで、コラーゲンが過剰産生され、肝線維化が発症する。これまでに、生理的発現量およびサイトカインなどの外部因子に対する応答性を有する「第2世代可視化I型プロコラーゲン発現システム」の開発を実施した。この「第２世代可視化I型プロコラーゲン発現システム」を導入した線維芽細胞では、コラーゲンの転写活性を促進するサイトカインTGF-β1で刺激することで、細胞内蛍光輝度の上昇し、および細胞内タンパク質発現量の増加が認められた。構築した「第２世代可視化I型プロコラーゲン発現システム」が外部因子に対する応答性を有することを確認した。2022年度は、「第２世代可視化I型プロコラーゲン発現」ベクターを、異なる活性化状態を示す2種類のラット肝星細胞株に遺伝子導入し、FACSによるシングルセル単離および薬剤選択により、安定発現株の樹立をおこなった。これにより各細胞株に対し、可視化I型プロコラーゲンを恒常的発現する細胞株を複数取得することに成功した。取得した細胞株は、活性化因子であるTGF-β1により、活性化マーカーであるαSMA遺伝子発現量の増加や静止期マーカーであるPpar-γ遺伝子発現量の低下がみられたことから、親株と同等の性質を保持していた。またTGF-β1による活性化誘導で、可視化I型コラーゲン由来の細胞内蛍光輝度の増加が認められ、かつ、細胞外への分泌量変化も検出されたことから、可視化I型プロコラーゲン発現肝星細胞の樹立に成功したと考える。現在、樹立細胞株を血管内皮細胞との共培養による、3次元組織培養モデル構築を進めている。

这项研究旨在使用所涉及的组开发的可视化I型Procollagen表达系统构建三维肝组织培养模型，并从胶原分子的角度阐明肝纤维化的机制。肝脏内的持续炎症反应在静止期激活了星状肝细胞，导致胶原蛋白的过量和肝纤维化的发育。到目前为止，我们已经开发了一种“可视化的I型Procollagen表达系统”，该系统对外部因素（例如生理表达水平和细胞因子）有反应。在这种“第二代可视化I型Procollagen表达系统”中引入的成纤维细胞中，刺激细胞因子TGF-β1，促进了胶原蛋白的转录活性，增加了细胞内荧光亮度并增加了细胞内蛋白质表达水平。已经确认，构建的“第二代可视化I型Procollagen表达系统”对外部因素具有反应。在2022年，将“第二代可视化的I型Procollagen表达”载体转移到两种类型的大鼠肝脏星状细胞系中，这些细胞表现出不同的活化态，并且通过通过FACS和药物选择分离单个细胞和药物选择来确定稳定的表达菌株。这成功获得了多个细胞系，这些细胞系组成型为每种细胞系表示可视化的I型Procollagen。获得的细胞系保留了与母菌株相同的特性，因为激活剂TGF-β1显示出αSMA基因表达的量增加，αSMA基因表达是激活标记物的，并且PPAR-γ基因表达的量减少，即固定标记物。此外，TGF-β1激活的诱导表明，从可视化的I型胶原蛋白中得出的细胞内荧光亮度也会增加，并且还检测到了分泌量的变化，这使得建立了可视化的I型procollagen表达肝肝脏的肝静脉曲sty细胞。目前，我们正在努力通过与血管内皮细胞共同培养建立的细胞系来构建三维组织培养模型。