口腔粘膜におけるSARS-CoV-2 結合受容体の免疫応答機構の解明

阐明口腔粘膜中SARS-CoV-2结合受体的免疫反应机制

基本信息

批准号：
21K17116
负责人：
鳴瀬貴子
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) の原因ウイルスである SARS-CoV-2 は細胞表面に存在するアンギオテンシン変換酵素 ACE2 を受容体として結合することが報告されている。ACE2 は口腔組織に発現していることが近年報告されているが，ACE2 の宿主免疫応答機構は不明である。本研究は口腔粘膜におけるウイルス感染に対するACE2 の新規宿主免疫応答機構を解明することを目的とする。2021年度，2022年度は口腔粘膜細胞におけるACE2の発現を検討した。不死化口腔粘膜上皮細胞RT7, 不死化歯肉線維芽細胞GT1 ，正常口腔粘膜上皮細胞，正常歯肉線維芽細胞の全RNAを抽出，cDNAを作成し，RT-PCR法によってACE2mRNAの発現を検討した。その結果，RT7,GT1 , 正常口腔粘膜細胞において定常的なACE2 mRNAの発現が認められた。またRT7,GT1の蛋白を抽出し，ACE2抗体を用いたWestern blotting 法によってACE2蛋白の発現を検討した。RT7,GT1において120kDの位置にACE2 蛋白のバンドが認められた。またRT7,GT1をチャンバースライドに培養し，ACE2抗体を用いた蛍光免疫染色を行った結果，RT7,GT1にACE2の局在が認められた。次にRT7, GT1 における核酸の細胞内導入によるACE2の発現誘導をReal-time PCR法にて検討した。RT7, GT1において一本鎖DNA, RNA添加，二本鎖DNA, RNA添加において両細胞におけるACE2発現誘導に変化は認められなかった。一方，一本鎖DNA, RNAの細胞内導入によっても両細胞におけるACE2 の発現に変化は認められなかったが，二本鎖DNA, RNAの細胞内導入によって著しいACE2の発現誘導が示された。

据报道，引起新型冠状病毒感染（COVID-19）的病毒 SARS-CoV-2 与细胞表面存在的血管紧张素转换酶 ACE2 作为受体结合。尽管最近有报道ACE2在口腔组织中表达，但ACE2的宿主免疫反应机制尚不清楚。本研究的目的是阐明ACE2针对口腔粘膜病毒感染的新型宿主免疫反应机制。 2021年和2022年，我们研究了口腔粘膜细胞中ACE2的表达情况。永生化口腔粘膜上皮细胞RT7、永生化牙龈成纤维细胞GT1、正常口腔粘膜上皮细胞、正常牙龈成纤维细胞提取总RNA，构建cDNA，采用RT-PCR检测ACE2 mRNA的表达。结果，在RT7、GT1和正常口腔粘膜细胞中观察到ACE2 mRNA的稳定表达。我们还提取了 RT7 和 GT1 蛋白，并使用 ACE2 抗体通过蛋白质印迹检查了 ACE2 蛋白的表达。在 RT7 和 GT1 的 120kD 位置观察到 ACE2 蛋白条带。此外，在室载玻片上培养RT7和GT1并使用ACE2抗体进行荧光免疫染色，结果在RT7和GT1中观察到ACE2的定位。接下来，我们使用实时 PCR 研究了通过在 RT7 和 GT1 中引入核酸来诱导 ACE2 表达。在 RT7 和 GT1 中，当添加单链 DNA、RNA、双链 DNA 或 RNA 时，两种细胞中 ACE2 表达的诱导没有观察到变化。另一方面，通过向细胞内导入单链DNA或RNA，两种细胞中的ACE2表达均未观察到变化，但通过向细胞内导入双链DNA或RNA，ACE2表达被显着诱导。