Elucidation of the mechanism of volume loss in long-term transplanted cartilage - Analysis using fluorescence imaging technique

阐明长期移植软骨体积损失的机制 - 使用荧光成像技术进行分析

基本信息

批准号：
21K16920
负责人：
力丸由起子
金额：
$ 2.16万
依托单位：
Kurume University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

皮下への軟骨移植後に軟骨量の減少と皮膚の菲薄化が起こる。先行研究では、移植床組織由来幹細胞から分化誘導された軟骨細胞が、移植軟骨の中に新生することを明らかにしたが、長期経過で軟骨量が減少する原因は未解明である。本研究では蛍光イメージング手法を用いて、軟骨減少の原因を解明することを目的とする。移植軟骨内/外の蛍光標識細胞の動態を可視化・定量解析し、(1)効率的に軟骨細胞に分化誘導される幹細胞の種類、(2)その最適付加量および(3)幹細胞の軟骨細胞誘導能が維持される期間の解明を行う。本研究によって術後の軟骨量の減少が起こりにくく、長期間組織量が保持される移植法の開発が可能になると考えている。 2021と2022年度は、蛍光標識した幹細胞群を生体内で可視化するモデルの作製(蛍光イメージング)をおこなった。この実験系では、脂肪由来幹細胞(ADSCs) に幹細胞標識用超低毒性色素(PKHリンカーキット)を用いて赤色蛍光標識した。蛍光標識反応は色素濃度に依存するために事前の調製の必要がある。また、蛍光色素の細胞膜標識の至適濃度を明らかにするために、SDラット皮下脂肪組織より単離された脂肪由来幹細胞を用いて、染色液の希釈系列を作製した。この実験系から脂肪幹細胞の蛍光イメージングに適用するPKHおよび核染色の至適濃度が明らかとなった。また、脂肪由来幹細胞の電子顕微鏡解析も合わせておこなったところ、細胞形態の異なる細胞群が存在する可能性が示唆された。幹細胞の超微形態についての情報が少なかったため、2022年度は移植前試料を用いて電子顕微鏡FIB/SEMおよびArray トモグラフィーを用いて形態解析を進めてきた。次年度は、移植モデルでの形態解析を進める予定である。

皮下软骨移植后，软骨数量减少，皮肤变薄。先前的研究表明，由移植床组织来源的干细胞诱导分化的软骨细胞可在移植软骨内再生，但软骨质量长期减少的原因仍不清楚。本研究的目的是利用荧光成像技术阐明软骨损失的原因。我们对移植软骨内部和外部的荧光标记细胞的动态进行可视化和定量分析，并确定了（1）可以有效诱导分化为软骨细胞的干细胞类型，（2）其最佳添加量，以及（3））我们将阐明细胞诱导能力维持的时期。我们相信，这项研究将使开发一种移植方法成为可能，该方法可降低术后软骨损失的风险并长期维持组织体积。 2021 年和 2022 年，我们创建了一个模型来可视化体内荧光标记的干细胞群（荧光成像）。在此实验系统中，使用用于干细胞标记的超低毒性染料（PKH Linker Kit）对脂肪干细胞（ADSC）进行红色荧光标记。荧光标记反应取决于染料浓度，需要提前准备。此外，为了明确荧光染料细胞膜标记的最佳浓度，使用从SD大鼠皮下脂肪组织中分离的脂肪干细胞制备了一系列稀释的染色溶液。该实验系统阐明了脂肪干细胞荧光成像的 PKH 和核染色的最佳浓度。对脂肪干细胞的电子显微镜分析也表明存在具有不同细胞形态的细胞群的可能性。由于有关干细胞超微形态学的信息很少，因此在 2022 财年，我们一直在使用电子显微镜 FIB/SEM 和使用移植前样本的阵列断层扫描进行形态学分析。明年，我们计划使用移植模型进行形态学分析。