A study of developing a rapid and comprehensive genetic testing method for the diagnosis and treatment of bloodstream infections

开发快速、全面的基因检测方法诊断和治疗血流感染的研究

基本信息

批准号：
21K16327
负责人：
青木弘太郎
金额：
$ 3万
依托单位：
Toho University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、血流感染症の原因菌をサブカルチャーを経ずに逐次全ゲノム解析 (WGS) により解析する検査法の開発を目的としている。初年度は、東邦大学医学部倫理委員会の承認を受けて、診療上必要な検査として提出された血液培養検査の残余検体の6検体を対象にプレリミナリーに検討を開始した。検査のTurn-Around-Time (TAT) を短縮するため、簡易的なDNA抽出方法によって得られたDNAをナノポア型超並列シークエンサー (MPS)のFlongle (オックスフォードナノポア・テクノロジーズ: ONT) に供したところ、菌種同定および薬剤耐性遺伝子解析に十分なリード出力が得られなかった。DNAサンプルの純度がリード出力低下に与える影響を低減するため、今年度は磁性ビーズを用いたDNA抽出法に切り替えてその後の検討を進めることとした。修正した一連のワークフローの妥当性を確認するため、研究代表者から採血した血液を血液培養ボトルに接種し、全ゲノム解析が完了している6菌種・各5株の薬剤耐性菌をそれぞれスパイクインして作製した擬似血液培養検体を用いた検討を開始した。2022年前期は購入したFlongleフローセルR9.4.1の品質にバラつきが大きく、安定的な出力が得られにくかった。しかし、2022年後期ではFlongleの品質が比較的向上し、Enterococcus属菌を除く5菌種で検出されるべき薬剤耐性遺伝子がすべて検出できる検体が30株中11株で確認された。2023年初頭から利用可能になったR10.4.1にバージョンアップされたFlongleおよびv14ライブラリ調整試薬に切り替えて同検討を進め、これまでの成績を上回るような高精度かつTATの短い逐次WGS開発を進める。

本研究旨在开发一种测试方法，通过连续全基因组分析（WGS）来分析血流感染的致病细菌，而无需经过传代培养。第一年，在获得东邦大学医学院伦理委员会的批准后，我们开始对作为临床必要测试提交的血培养测试剩余的六个样本进行初步研究。为了缩短测试周转时间（TAT），将通过简单DNA提取方法获得的DNA置于纳米孔大规模并行测序仪（MPS）Flongle（Oxford Nanopore Technologies：ONT）中，但未获得足够的读取输出。细菌种类鉴定和耐药基因分析。为了减少DNA样本纯度对读数输出下降的影响，我们决定今年改用磁珠提取DNA的方法，并继续进行后续研究。为了证实修订后的系列工作流程的有效性，我们将主要研究者抽取的血液接种到血培养瓶中，并在每个血培养瓶中添加6种耐药菌，每种耐药菌5株，并对其进行全基因组分析。我们已经开始使用以这种方式制备的模拟血培养标本进行调查。 2022年上半年，我们购买的Flongle流通池R9.4.1质量参差不齐，难以获得稳定产量。但到了2022年底，Flongle的质量已相对改善，在30株菌株中，有11株样本中确认了除肠球菌外的5个菌种中应检出的所有耐药基因。我们将改用Flongle和v14文库制备试剂，这些试剂已更新至R10.4.1，将于2023年初上市，并继续进行相同的研究，并继续进行高精度和短TAT的连续WGS开发，将超过之前的成绩。