Development of airway epithelial keratinization and barrier function as a novel therapeutic target for asthma

气道上皮角化和屏障功能的发展作为哮喘的新治疗靶点

• 批准号: 21K16308
• 负责人: 井上 英樹
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Showa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K16308/
• 关键词: 重症喘息; 気道上皮; 真菌; 喘息; アレルギー性喘息; 喘息モデルマウス; 気道炎症; 気道上皮バリアー; 角層蛋白

真菌の気道上皮への曝露への影響を検討するため、気道上皮細胞の培養を用い、真菌抽出液を培地に加えその影響の検討を行った。in vitroでの検討として気道上皮細胞として16HBE14o-, Calu-3の細胞株を用い、培地に浸した状態(submerged)での刺激実験を行った。アレルゲン曝露としてアルテルナリア抽出液の曝露を行い、気道上皮の状態や各種サイトカインの分泌の検討を行った。高濃度のアルテルナリア抽出液の曝露は細胞へのダメージが大きく、細胞死に至ったが、一定濃度以下のアルテルナリア濃度の曝露によっては細胞死には至らなかった。上皮角層蛋白の遺伝子発現を解析したところ、ある一定濃度のアルテルナリア抽出液の曝露によって上皮角層蛋白の１種であるケラチン6bの遺伝子発現の増加が認められた。アルテルナリア抽出液曝露によるサイトカイン分泌を評価するため細胞上清中のサイトカインの測定を行った。IL-6, IL-8などの炎症性サイトカインの測定を行ったが、今回測定した条件下においては有意な変化は認められなかった。アルテルナリア抽出液の濃度および、ELISAの測定条件、細胞上清中の濃度の調整を行い、引き続き検討を行っている状況である。より生体に近い条件での気道上皮細胞の評価を行うため、気相―液相培養(ALI培養)の検討を行った。気道上皮細胞株である16HBE14o-を用いsubmergedの条件下においては、細胞培養はコンフルエントの状況に至ったが、TranswellインサートによるALI培養では、コンフルエントの状況を維持することが難しく、細胞死に至る状況であった。今後、培養液の変更や培養期間の調整を行うことによって、実験に供しうるALI培養の状態を維持するための条件を引き続き検討を行っている状況である。

为了检查真菌暴露对气道上皮的影响，我们使用气道上皮细胞培养物，并向培养基中添加真菌提取物。对于体外研究，使用16HBE14o-、Calu-3细胞系作为浸没在培养基中的气道上皮细胞进行刺激实验。我们使用链格孢提取物作为过敏原暴露，并检查气道上皮的状况和各种细胞因子的分泌。暴露于高浓度的链格孢提取物会对细胞造成显着损伤，导致细胞死亡，但暴露于低于一定浓度的链格孢提取物不会导致细胞死亡。当我们分析上皮角质层蛋白的基因表达时，我们发现接触一定浓度的链格孢提取物会增加角蛋白6b（一种上皮角质层蛋白）的基因表达。为了评估暴露于链格孢提取物后细胞因子的分泌，测量了细胞上清液中的细胞因子。测定了IL-6、IL-8等炎症细胞因子，但在本次测定的条件下未观察到明显变化。链格孢提取物的浓度、ELISA测量条件和细胞上清液中的浓度已经调整，进一步的研究正在进行中。为了在更类似于活体的条件下评估气道上皮细胞，我们研究了气液培养（ALI 培养）。使用气道上皮细胞系16HBE14o-在浸没条件下，细胞培养达到汇合状态，但在使用Transwell插入物的ALI培养中，难以维持汇合状态，并且这种情况导致细胞死亡。今后，我们将继续通过更换培养基和调整培养时间来研究维持适合实验的ALI培养条件的条件。

项目成果

Comprehensive Gene Expression Signature Using RNA-Seq in Airways of Mouse Model of Severe Asthma with Fungal Sensitization

• DOI: 10.1159/000519172
• 发表时间: 2021-09-29
• 期刊: INTERNATIONAL ARCHIVES OF ALLERGY AND IMMUNOLOGY
• 影响因子: 2.8
• 作者: Inoue, Hideki;Akimoto, Kaho;Sagara, Hironori
• 通讯作者: Sagara, Hironori