全ゲノムシーケンス法による小腸腺癌遺伝子の網羅的解析と治療薬開発の基盤研究

利用全基因组测序综合分析小肠腺癌基因及治疗药物开发基础研究

• 批准号: 21K15952
• 负责人: 藤本 将太
• 金额: $ 3万
• 依托单位: The University of Tokushima
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K15952/
• 关键词: 小腸腺癌; がん抑制遺伝子; 全ゲノムシーケンス解析; 全ゲノムシーケンス

小腸腺癌の発癌に関わるがん抑制遺伝子の候補として、昨年度、全ゲノムシーケンス解析により抽出した遺伝子を小腸正常細胞でsiRNAによりノックダウンすることで細胞増殖能の増加がみられた遺伝子A, B, C, D, Eを抽出した。今年度は大腸内視鏡を施行した症例①、症例②、症例③の回腸末端小腸粘膜より樹立した小腸オルガノイド①, ②, ③に対して、shRNAシステムを用いて候補遺伝子A, B, C, D, Eをそれぞれノックダウンし、細胞増殖能の変化をCell titer Glo assayにより評価した。小腸オルガノイドに対して、それぞれの遺伝子につき、異なる2種類のshRNAを導入したところ、候補遺伝子A, B, C, D, Eのノックダウン効率は約60～80%であった。各遺伝子のshRNAを導入した小腸オルガノイドを96 well plateに播種し、day0, day3, day5, day7でそれぞれCell titer Glo試薬により細胞数を定量し、day0に対する細胞増殖率をそれぞれ算出した。これらをnegative control shRNAを導入した小腸オルガノイドの細胞増殖率と比較したところ、day7において、遺伝子Dは約1.5倍、遺伝子Eは約2.0倍と有意に細胞増殖率の上昇を示した (p<0.05)。一方、遺伝子A, B, Cにおいては、negative control と比較し、細胞増殖率の有意な上昇を示さなかった。したがって、遺伝子Dと遺伝子Eを小腸腺癌の発癌に関わるがん抑制遺伝子の候補として絞り込んだ。現在、これらの遺伝子を導入したオルガノイドをヌードマウスに移植し、腫瘍形成能を評価している。

去年提取的基因 A 和 B，作为参与小肠腺癌发生的肿瘤抑制基因的候选基因，当使用 siRNA 在正常小肠细胞中敲除这些基因时，显示出细胞增殖的增加。和E被提取。今年，候选基因A、B、C、D和E分别被敲低，并通过细胞滴度Glo测定评估细胞增殖能力的变化。当将每个基因的两种不同类型的shRNA引入小肠类器官时，候选基因A、B、C、D和E的敲低效率约为60-80%。将导入各基因shRNA的小肠类器官接种于96孔板中，使用Cell titer Glo试剂在第0天、第3天、第5天和第7天对细胞数进行定量，并相对于细胞增殖率计算到第 0 天。当将这些与引入阴性对照shRNA的小肠类器官的细胞增殖率进行比较时，在第7天，细胞增殖率显着增加，基因D的细胞增殖率显着增加约1.5倍，基因E的细胞增殖率显着增加约2.0倍(p<0.05)。另一方面，与阴性对照相比，基因A、B和C没有表现出细胞增殖率的显着增加。因此，我们缩小了基因D和基因E作为参与小肠腺癌癌变的抑癌基因候选基因的范围。目前，含有这些基因的类器官正在被移植到裸鼠体内，并正在评估它们的肿瘤形成潜力。