Elucidation of Stim2 splicing mechanism and development of a novel therapeutic strategy of heart failure

阐明Stim2剪接机制并开发心力衰竭新治疗策略

基本信息

批准号：
21K15277
负责人：
伊藤淳平
金额：
$ 3万
依托单位：
National Cardiovascular Center Research Institute (2022)Osaka Medical and Pharmaceutical University (2021)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

心不全患者では心筋細胞内カルシウムイオン濃度が上昇していること、そして増加に伴い心機能の悪化を惹起しているためカルシウムイオン濃度を調節するタンパク質を標的とした創薬が心機能改善に有効である。本研究では、カルシウムイオンを貯蓄する小胞体のカルシウムイオンの枯渇により流入を引き起こすストア作動性カルシウム流入に着目し、その構成タンパク質であるSTIM2とそのスプライシング機構を調整することによりカルシウム流入を微調整できるような心不全治療薬の開発を目指す。今年度は、Stim2の選択的スプライシングに関与する因子の同定を試みた。心臓組織抽出液と5’末端をビオンチンで修飾した合成RNAを用いてRNAプルダウンアッセイを行い、結合したタンパク質を質量分析によって解析したところ、あるスプライシング調節因子が検出された。検出されたスプライシング調節分子をクローニングし、マウス筋芽細胞株C2C12に過剰発現させることでSTIM2.1/STIM2.2比の変化することを確認した。また、同様にC2C12細胞にスプライス調節分子を過剰発現させることでストア作動性カルシウム流入が変化することも確認した。さらに、本スプライシングが関与するexionやintronをクローニングしミニ遺伝子を作製し、バイオインフォマティクスツールにより複数予測されたRNA上の結合配列に変異を導入し、結合配列領域の同定を行った。その結果、本スプライシング調節因子の結合領域が同定された。

在心力衰竭患者中，心肌细胞内的钙离子浓度增加，这种增加会导致心脏功能恶化，因此，针对调节钙离子浓度的药物的发现可能会有效改善心脏功能。在本研究中，我们重点关注由储存钙离子的内质网中钙离子耗尽引起的钙库操纵钙内流，并通过调整其组成蛋白STIM2及其剪接机制来微调钙内流。是开发治疗心力衰竭的药物。今年，我们试图确定参与 Stim2 选择性剪接的因素。使用心脏组织提取物和 5' 端生物素修饰的合成 RNA 进行 RNA Pull-down 测定，通过质谱分析结合的蛋白质，并检测剪接调节因子。将检测到的剪接调节分子克隆并在小鼠成肌细胞系C2C12中过表达，证实STIM2.1/STIM2.2比例发生改变。我们还证实，在 C2C12 细胞中过度表达剪接调节分子可以改变钙池操纵的钙内流。此外，我们通过克隆参与这种剪接的外显子和内含子创建了小基因，将突变引入使用生物信息学工具预测的RNA上的多个结合序列中，并鉴定了结合序列区域。结果，鉴定了该剪接调节因子的结合区域。