出芽酵母を用いた肥満制御因子ACBPの細胞外放出機構の研究

酿酒酵母肥胖调节剂ACBP胞外释放机制研究

基本信息

批准号：
21K15093
负责人：
平田恵理
金额：
$ 2.91万
依托单位：
The University of Tokyo (2022)Waseda University (2021)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K15093/
关键词：
出芽酵母 ACBP 細胞外分泌 Acb1 Rim101 肥満

项目摘要

現代社会において、肥満率の増加は世界的な問題となっている。ごく最近になって、哺乳動物においてAcyl-CoA-binding protein (ACBP)の細胞外放出量が肥満をコントロールしている可能性が示唆された。しかしながら、ACBPがどうやって細胞外へ放出されているのか、その分子機構はほとんど分かっていない。そこで本研究では出芽酵母の遺伝学を用いてACBP放出経路の解明を目標とした。我々のこれまでの研究により、酵母のACBP放出に関わる遺伝子群の一次スクリーニングが完了している。同定した遺伝子群には細胞膜ストレス応答に必要なRim101経路や膜のリモデリングに必要なESCRT遺伝子群が含まれていた。一方で、他グループの先行研究で関与が示唆されていたオートファゴソーム形成に関連した遺伝子群は、我々のスクリーニング結果には含まれていなかった。また、前年度のACBP-NanoLucを用いた研究結果より、オートファジー関連遺伝子群の欠損株においても出芽酵母の培養上清にACBP-NanoLucが放出されている可能性を見出している。そこで本年度は、新たに作製したACBP抗体を用いて培養上清に放出されるACBPタンパク質をウェスタンブロットにより検出することを試みた。ACBPは細胞外に放出される際に切断を受ける可能性が示唆されているため、切断後のペプチド配列を認識する抗体も新たに作製し、　切断されたACBPタンパク質を検出できるか検証した。その結果、ACBP全長を認識する抗体を使用するとACBPのバンドが検出できることが確認された。一方で、切断されたACBPペプチドを認識する抗体ではバンドを検出することができなかった。しかしながら、今回検証したACBP全長を認識する抗体を用いることで、培養上清に放出されたACBPタンパク質を検出できる可能性が示唆された。

在现代社会，肥胖率不断上升已成为一个世界性问题。最近，有人提出，酰基辅酶A结合蛋白（ACBP）的细胞外释放量可以控制哺乳动物的肥胖。然而，ACBP 如何从细胞中释放的分子机制尚不清楚。因此，在本研究中，我们旨在利用酿酒酵母遗传学阐明 ACBP 释放途径。我们前期的研究已经完成了酵母中ACBP释放相关基因的初步筛选。鉴定出的基因包括细胞膜应激反应所需的 Rim101 途径和膜重塑所需的 ESCRT 基因。另一方面，其他小组之前的研究表明与自噬体形成相关的基因并未包含在我们的筛选结果中。此外，根据去年使用ACBP-NanoLuc的研究结果，我们发现即使在缺乏自噬相关基因的菌株中，ACBP-NanoLuc也可能被释放到酿酒酵母的培养上清液中。因此，今年，我们尝试使用新创建的 ACBP 抗体通过蛋白质印迹法检测释放到培养上清液中的 ACBP 蛋白。有人认为ACBP在释放到细胞外时可能会被切割，因此我们创建了一种新的抗体来识别切割的肽序列，并验证它是否可以检测切割的ACBP蛋白。结果证实，使用识别ACBP全长的抗体可以检测ACBP条带。另一方面，使用识别切割的 ACBP 肽的抗体无法检测到条带。然而，有人建议，可以使用识别本研究中测试的全长 ACBP 的抗体来检测释放到培养物上清液中的 ACBP 蛋白。