重水素化支援中性子小角散乱と超遠心分析の複合解析による時計蛋白質複合体の構造解析

通过氘化辅助小角中子散射和超速离心分析的组合分析时钟蛋白复合物的结构

• 批准号: 21K15051
• 负责人: 守島 健
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K15051/
• 关键词: 時計タンパク質; X線小角散乱; 中性子小角散乱; 超遠心分析; AUC-SAS; 重水素化支援中性子小角散乱; 時計蛋白質

Kai時計タンパク質の概日振動の制御機構を理解するためには、3種類のKaiタンパク質（KaiA, KaiB, KaiC）が形成する複合体の形成メカニズムや構造を明らかにする必要である。本研究では特に、リン酸化亢進に重要な役割を果たすKaiA-KaiC複合体（AC複合体）の形成挙動とその構造を解明することを目的としている。溶液中での構造を解明するために、超遠心分析（AUC）とX線及び中性子小角散乱（SAXS及びSANS、総称してSAS）を組み合わせたAUC-SAS法を用いて、KaiAとKaiCの解離会合平衡下でのAC複合体のみに由来した散乱データを選択的に取得する。さらに、KaiAあるいはKaiCの重水素化ラベルを用いたSANS測定により、複合体の一部を散乱データ上で不可視化して、AC複合体の部分構造を解明し、AC複合体がリン酸化を亢進するメカニズムの詳細に迫ることを目指している。初年度（2021年度）は、非変性質量分析（Native-MS）とAUCによるAC複合体の形成条件検討を詳細に行い、会合数の化学量論比や解離定数を明らかにした。得られた知見をもとに、SAXS測定で得られた溶液散乱データを、AUC-SAXS法によって成分分離し、AC複合体のみに由来するSAXSプロファイルを取得することに成功した。2年目（2022年度）は、重水素化ラベルKaiA及びKaiCを用いた逆転コントラストマッチングSANS測定とAUC-SASを組み合わせることによって、AC複合体中のKaiA及びKaiCに由来する散乱プロファイルを取得することに成功した。現在は上述のSAXS及びSANSプロファイルと計算機シミュレーションを組み合わせることで、溶液中のAC複合体の構造・ダイナミクスの解析を進めている。

为了了解Kai时钟蛋白昼夜节律振荡的控制机制，有必要明确三类Kai蛋白（KaiA、KaiB、KaiC）形成的复合物的形成机制和结构。特别是，本研究旨在阐明 KaiA-KaiC 复合物（AC 复合物）的形成行为和结构，该复合物在增加磷酸化方面发挥着重要作用。为了阐明溶液中的结构，我们使用 AUC-SAS 方法，结合超速离心 (AUC) 和 X 射线和小角中子散射（SAXS 和 SANS，统称为 SAS）来解离 KaiA 和 KaiC。选择性地获取仅从缔合平衡下的AC复合物导出的数据。此外，使用 KaiA 或 KaiC 氘化标记的 SANS 测量使复合物的一部分在散射数据上不可见，阐明了 AC 复合物的部分结构，并表明 AC 复合物增加了磷酸化，我们的目标是深入了解该机制的细节。导致这种情况。第一年（2021年度），我们利用非变性质谱（Native-MS）和AUC详细研究了AC复合物的形成条件，并明确了缔合数和解离常数的化学计量比。基于所获得的知识，我们使用AUC-SAXS方法分离了通过SAXS测量获得的溶液散射数据，并成功获得了仅源自AC复合体的SAXS轮廓。第二年（2022 年），我们将通过将 AUC-SAS 与成功使用氘代标签 KaiA 和 KaiC 的反向对比度匹配 SANS 测量相结合，获得来自 AC 复合物中的 KaiA 和 KaiC 的散射剖面。我们目前正在通过将上述 SAXS 和 SANS 配置文件与计算机模拟相结合来分析溶液中 AC 复合物的结构和动力学。

项目成果

生物物理と計算科学の統合手法による時計タンパク質KaiABC複合体全長の溶液構造の解明

利用生物物理学和计算科学的综合方法阐明全长时钟蛋白 KaiABC 复合物的溶液结构

• 发表时间: 2022
• 作者: 柚木康弘;松本淳;守島健;Anne Martel;Lionel Porcar;佐藤信浩;與語理那;富永大輝;井上倫太郎;矢木真穂;奥田綾;清水将裕;裏出令子;寺内一姫;河野秀俊;矢木宏和;加藤晃一 ;杉山正明
• 通讯作者: 杉山正明

ウシ由来インスリンのアミロイド核形成に見られるオリゴマーおよびプロトフィブリル形成機構

牛胰岛素淀粉样蛋白成核中观察到的寡聚物和原纤维形成机制

• 发表时间: 2022
• 作者: 柚佳祐;今村比呂志;野崎拓郎;藤井悠生;守島健;奥田綾;井上倫太郎;杉山正明;茶谷絵理
• 通讯作者: 茶谷絵理

好熱性古細菌由来天然変性タンパク質の生理的温度における動的構造とダイナミクス

生理温度下嗜热古菌自然变性蛋白质的动态结构和动力学

• 发表时间: 2022
• 作者: 小田 隆;井上 倫太郎;富永 大輝;中川 洋;守島 健;岩瀬 裕希;石野 良純;佐藤 衛;杉山 正明
• 通讯作者: 杉山 正明

多分散・多成分溶液中の生体高分子の構造解析のための小角散乱と各種成分分離手法の複合的アプローチ

小角散射和各种组分分离方法相结合，用于多分散/多组分溶液中生物聚合物的结构分析

• 发表时间: 2022
• 期刊: 波紋
• 作者: 守島健;佐藤信浩;井上倫太郎;杉山正明
• 通讯作者: 杉山正明

アミロイド核形成段階におけるウシ由来インスリンの多段階凝集メカニズム

牛胰岛素在淀粉样蛋白成核阶段的多步聚集机制

• 发表时间: 2022
• 作者: 柚佳祐;今村比呂志;野崎拓郎;藤井悠生;守島健;奥田綾;井上倫太郎;杉山正明;茶谷絵理
• 通讯作者: 茶谷絵理