Elucidation of the mechanism of pathogenicity of Rhodococcus equi in ruminants and establishment of a diagnostic method

马红球菌对反刍动物致病机制的阐明及诊断方法的建立

基本信息

批准号：
21K14975
负责人：
鈴木康規
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kitasato University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K14975/
关键词：
ロドコッカス・エクイ病原性プラスミドゲノム解析 RNA-Seq アンチセンスRNA プロモーター活性モノクローナル抗体自家生物発光 RP R. equi VapN Whole genome sequencing RNA Seq Monoclonal antibody

项目摘要

前年度の研究より、VapN発現にはvapNアンチセンス鎖（AS鎖）RNAによる発現制御が関与することを見出した。そこでAS鎖プロモーター配列を用いたDNAプルダウンを行い、本領域に特異的に結合する転写制御因子の特定を試みた結果、転写制御因子してGntRが同定された。続いて、非産生株のgntR欠損株及び補完株を作出した。gntR欠損株においてVapN発現が増加し、補完株でその発現が減少した。さらに、AS鎖プロモーター活性は、gntR欠損株において野生株と比較して有意に減少し、補完株で野生株と同程度まで活性が戻った。すなわち、VapN発現において、GntRによるAS鎖RNA発現を介した抑制機構が存在することが示唆された。前年度作出した抗VapNモノクローナル抗体を用いて、VapN産生株を感染させたマウスの免疫染色を行った結果、肝臓、脾臓の壊死性病変に陽性反応が認められた。また、VapN陽性R. equiに感染したと推定されるヤギおよびウシの免疫染色では、肺、リンパ節、肋骨などの壊死病変を有する臓器で陽性反応が認められた。本抗体を用いた免疫学的診断法は、類症鑑別やこれまで見逃されていた症例の特定に利用できる。また、本年度は自家生物発光を利用した病原性評価法の改良を行った。恒常発現プロモーターにluxABCDEをつなぎ、各種R. equi株に導入したところ、化学発光を検出し、菌数と発光強度に相関が認められた。また、それらの形質転換体を培養マクロファージに感染させた場合、細胞内で増殖可能な強毒株由来の形質転換体で発光を検出した。続いて、IVISを用いてマウス生体内における増殖性を検討した結果、強毒株由来の形質転換体では、投与3日後に肝臓と脾臓に発光を検出した。以上より、本自家発光株は、R. equiの病原性解析を強化するものと考えられる。

去年的一项研究发现，VAPN表达涉及通过VAPN反义链（作为链）RNA的表达控制。因此，使用AS链启动子序列进行DNA下拉以识别特异性结合该区域的转录调节剂，并且将GNTR鉴定为转录调节剂。接下来，产生了未产生的GNTR缺陷和互补菌株。 GNTR缺陷菌株中VAPN的表达增加，互补菌株中其表达降低。此外，与野生菌株相比，GNTR缺陷菌株的肌链启动子活性显着降低，互补菌株恢复到与野生菌株相似的活性。也就是说，有人提出，通过AS链RNA表达，GNTR在VAPN表达中具有抑制的机制。使用上一年产生的抗VAPN单克隆抗体，免疫染色，感染了产生VAPN的菌株的小鼠，发现阳性反应在肝脏和脾脏中的坏死病变中。此外，山羊和牛的免疫染色，大概是感染了VAPN阳性的R. Equi，在患有肺，淋巴结和肋骨等坏死病变的器官中观察到阳性反应。使用该抗体的免疫学诊断方法可用于区分相同类型并识别以前被忽略的病例。此外，今年我们使用自体发光改善了致病性评估方法。当将卢克斯科德连接到组成型表达启动子并引入各种股。Equi菌株时，检测到化学发光，并观察到细菌数量与发光强度之间存在相关性。此外，当这些转化体被培养的巨噬细胞感染时，在源自细胞中可能增殖的有毒菌株的转化体中检测到发光。随后，使用IVI检查了小鼠的增殖特性，并在施用后三天在肝脏中检测到肝脏和脾脏中的发光。基于上述，人们认为这种自发光菌株增强了R. equi的致病性分析。