Elucidation of the mechanism of pathogenicity of Rhodococcus equi in ruminants and establishment of a diagnostic method

马红球菌对反刍动物致病机制的阐明及诊断方法的建立

基本信息

批准号：
21K14975
负责人：
鈴木康規
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kitasato University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K14975/
关键词：
ロドコッカス・エクイ病原性プラスミドゲノム解析 RNA-Seq アンチセンスRNA プロモーター活性モノクローナル抗体自家生物発光 RP R. equi VapN Whole genome sequencing RNA Seq Monoclonal antibody

项目摘要

前年度の研究より、VapN発現にはvapNアンチセンス鎖（AS鎖）RNAによる発現制御が関与することを見出した。そこでAS鎖プロモーター配列を用いたDNAプルダウンを行い、本領域に特異的に結合する転写制御因子の特定を試みた結果、転写制御因子してGntRが同定された。続いて、非産生株のgntR欠損株及び補完株を作出した。gntR欠損株においてVapN発現が増加し、補完株でその発現が減少した。さらに、AS鎖プロモーター活性は、gntR欠損株において野生株と比較して有意に減少し、補完株で野生株と同程度まで活性が戻った。すなわち、VapN発現において、GntRによるAS鎖RNA発現を介した抑制機構が存在することが示唆された。前年度作出した抗VapNモノクローナル抗体を用いて、VapN産生株を感染させたマウスの免疫染色を行った結果、肝臓、脾臓の壊死性病変に陽性反応が認められた。また、VapN陽性R. equiに感染したと推定されるヤギおよびウシの免疫染色では、肺、リンパ節、肋骨などの壊死病変を有する臓器で陽性反応が認められた。本抗体を用いた免疫学的診断法は、類症鑑別やこれまで見逃されていた症例の特定に利用できる。また、本年度は自家生物発光を利用した病原性評価法の改良を行った。恒常発現プロモーターにluxABCDEをつなぎ、各種R. equi株に導入したところ、化学発光を検出し、菌数と発光強度に相関が認められた。また、それらの形質転換体を培養マクロファージに感染させた場合、細胞内で増殖可能な強毒株由来の形質転換体で発光を検出した。続いて、IVISを用いてマウス生体内における増殖性を検討した結果、強毒株由来の形質転換体では、投与3日後に肝臓と脾臓に発光を検出した。以上より、本自家発光株は、R. equiの病原性解析を強化するものと考えられる。

通过去年的研究，我们发现VapN的表达受vapN反义链（AS链）RNA的调控。因此，我们利用AS链启动子序列进行DNA Pulldown，并试图鉴定与该区域特异性结合的转录调节因子，结果，GntR被鉴定为转录调节因子。随后，创建了 gntR 缺陷菌株和补充菌株（它们是非生产菌株）。 gntR 缺陷菌株中 VapN 表达增加，而补充菌株中 VapN 表达减少。此外，与野生型菌株相比，gntR缺陷菌株的AS链启动子活性显着降低，而在补充菌株中活性恢复到与野生型菌株相同的水平。换句话说，表明存在通过GntR表达AS链RNA来抑制VapN表达的机制。使用前一年制备的抗VapN单克隆抗体对感染VapN产生株的小鼠进行免疫染色，结果在肝脏和脾脏的坏死病灶中观察到阳性反应。此外，对推测感染了VapN阳性马罗拉病毒的山羊和牛的免疫染色显示，肺、淋巴结和肋骨等有坏死病变的器官出现阳性反应。使用这种抗体的免疫学诊断方法可用于区分类似的疾病并识别迄今为止被忽视的病例。此外，今年我们改进了利用自体生物发光的致病性评估方法。当luxABCDE与组成型表达启动子连接并导入各种马菌菌株时，检测到化学发光，并观察到细菌数量和发光强度之间的相关性。此外，当培养的巨噬细胞被这些转化体感染时，在源自可在细胞内增殖的高毒力菌株的转化体中检测到发光。随后，我们使用IVIS检查了小鼠的增殖能力，结果，在施用3天后，在源自高毒力菌株的转化体的肝脏和脾脏中检测到发光。综上所述，该自发光菌株被认为增强了马罗氏菌的致病性分析。