複数の炭素源の同時利用を前提とした合理的代謝設計による高収率物質生産技術の開発

基于多种碳源同时利用的合理代谢设计开发高产材料生产技术

基本信息

批准号：
21K14777
负责人：
藤原良介
金额：
$ 3万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

メタノールおよびグリセロールを同時に資化可能なM. extorquens代謝改変株の構築を行った。M. extorquens野生株に対してputative glycerol kinase(Mext_4066) をプラスミドを利用して過剰発現させることで、グリセロール単一炭素源での増殖を確認した。続いてゲノム上に同遺伝子を組み込んだ株を構築し、同様の培地での培養を行ったが、細胞増殖速度は野生株と同程度であった。このことからグリセロールの効率的な資化にはMext_4066をプラスミドにより高発現させる必要があることが示唆された。また、メタノール由来の炭素を目的生産物に効率的に利用するため、競合反応を触媒する酵素であるギ酸デヒドロゲナーゼ(FDH)の破壊を行った。接合伝達大腸菌を用いた遺伝子破壊の操作において、大腸菌-M. extorquens混合培養体からM. extorquensのみを得るために大腸菌が増殖できないメタノール培地での培養を行うステップがあるが、本研究ではメタノール資化経路の破壊を行うため、別の原理によるスクリーニング法の開発が必要となった。そこでクロラムフェニコール耐性遺伝子をゲノム上に組み込み、新たな遺伝子破壊操作プロトコルを確立した。この遺伝子破壊プロトコルを用いて、3つのFDH遺伝子(Mext_4582, Mext_0389, Mext_4405-4406)を破壊した3重破壊株の作成に成功した。現在、残る1つのFDHアイソザイムであるFDH4(Mext_2105)の破壊株を構築中である。

我们构建了一种代谢工程菌株，可以同时同化甲醇和甘油。通过使用质粒在 M. extorquens 野生菌株中过表达假定的甘油激酶 (Mext_4066)，我们证实了在单一甘油碳源上的生长。接下来，构建了基因组中整合有相同基因的菌株，并在相同的培养基中培养，但细胞生长速度与野生菌株相当。这表明有必要使用质粒高度表达Mext_4066以实现有效的甘油同化。此外，为了有效利用来自甲醇的碳来生产所需的产品，我们破坏了甲酸脱氢酶（FDH），这是一种催化竞争反应的酶。在使用接合转移大肠杆菌的基因破坏操作中，存在在大肠杆菌不能生长的甲醇培养基中培养的步骤，以便从大肠杆菌-M中仅获得M. extorquens。，有必要开发一种基于不同原理的筛选方法。因此，我们将氯霉素抗性基因整合到基因组中，并建立了新的基因破坏操作方案。使用该基因破坏方案，我们成功创建了三重破坏菌株，其中三个 FDH 基因（Mext_4582、Mext_0389、Mext_4405-4406）被破坏。我们目前正在构建 FDH4 (Mext_2105) 的破坏菌株，这是唯一剩余的 FDH 同工酶。

项目成果

期刊论文数量（2）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Caffeic acid production from glucose using metabolically engineered Escherichia coli

使用代谢工程大肠杆菌从葡萄糖生产咖啡酸

DOI：
10.1016/j.enzmictec.2023.110193
发表时间：
2023
期刊：
Enzyme and Microbial Technology
影响因子：
3.4
作者：
Sakae Kosuke;Nonaka Daisuke;Kishida Mayumi;Hirata Yuuki;Fujiwara Ryosuke;Kondo Akihiko;Noda Shuhei;Tanaka Tsutomu
通讯作者：
Tanaka Tsutomu