複数の炭素源の同時利用を前提とした合理的代謝設計による高収率物質生産技術の開発

基于多种碳源同时利用的合理代谢设计开发高产材料生产技术

基本信息

批准号：
21K14777
负责人：
藤原良介
金额：
$ 3万
依托单位：
Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

メタノールおよびグリセロールを同時に資化可能なM. extorquens代謝改変株の構築を行った。M. extorquens野生株に対してputative glycerol kinase(Mext_4066) をプラスミドを利用して過剰発現させることで、グリセロール単一炭素源での増殖を確認した。続いてゲノム上に同遺伝子を組み込んだ株を構築し、同様の培地での培養を行ったが、細胞増殖速度は野生株と同程度であった。このことからグリセロールの効率的な資化にはMext_4066をプラスミドにより高発現させる必要があることが示唆された。また、メタノール由来の炭素を目的生産物に効率的に利用するため、競合反応を触媒する酵素であるギ酸デヒドロゲナーゼ(FDH)の破壊を行った。接合伝達大腸菌を用いた遺伝子破壊の操作において、大腸菌-M. extorquens混合培養体からM. extorquensのみを得るために大腸菌が増殖できないメタノール培地での培養を行うステップがあるが、本研究ではメタノール資化経路の破壊を行うため、別の原理によるスクリーニング法の開発が必要となった。そこでクロラムフェニコール耐性遺伝子をゲノム上に組み込み、新たな遺伝子破壊操作プロトコルを確立した。この遺伝子破壊プロトコルを用いて、3つのFDH遺伝子(Mext_4582, Mext_0389, Mext_4405-4406)を破壊した3重破壊株の作成に成功した。現在、残る1つのFDHアイソザイムであるFDH4(Mext_2105)の破壊株を構築中である。

M.肌肉代谢修饰的菌株，可以同时吸收甲醇和甘油。通过使用质粒过表达了推定的甘油激酶（MEXT_4066），确认了野生M.脱酮菌株上推定的甘油激酶（MEXT_4066）的扩散。然后在基因组上构建了包含相同基因的菌株并在相似的培养基中培养，但是细胞生长速率与野生菌株相似。这表明墨西哥4066的高表达对于有效的甘油利用率是必需的。此外，为了有效利用甲醇衍生的碳作为目标产物，甲酸盐脱氢酶（FDH）（一种催化竞争反应的酶）被中断。在使用共轭大肠杆菌对基因破坏进行操纵时，在甲醇培养基中培养了一个步骤，其中大肠杆菌无法生长以仅获得大肠杆菌M. Excorquens。偏僻的混合文化。但是，在这项研究中，需要使用不同原理的筛选方法开发来破坏甲醇辅助途径。因此，将氯霉素抗性基因纳入了基因组，并建立了新的基因破坏操作方案。使用此基因破坏协议，我们成功创建了一个破坏三个FDH基因的三重菌株（MEXT_4582，MEXT_0389，MEXT_4405-4406）。目前，我们正在建立FDH4（MEXT_2105）的破坏性菌株，剩下的FDH同工酶。

项目成果

期刊论文数量（2）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Caffeic acid production from glucose using metabolically engineered Escherichia coli

使用代谢工程大肠杆菌从葡萄糖生产咖啡酸

DOI：
10.1016/j.enzmictec.2023.110193
发表时间：
2023
期刊：
Enzyme and Microbial Technology
影响因子：
3.4
作者：
Sakae Kosuke;Nonaka Daisuke;Kishida Mayumi;Hirata Yuuki;Fujiwara Ryosuke;Kondo Akihiko;Noda Shuhei;Tanaka Tsutomu
通讯作者：
Tanaka Tsutomu