新規細胞培養系とノックアウト個体を用いたメダカ精原細胞の増殖・分化機構の解析

利用新型细胞培养体系和基因敲除个体分析青鳉精原细胞的增殖和分化机制

• 批准号: 24657043
• 负责人: 山下 正兼
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012-04-01 至 2014-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-24657043/
• 关键词: 精子形成; メダカ; サイトカイン; 細胞培養; 体細胞分裂; 減数分裂; 精子形成; メダカ; サイトカイン; 細胞培養; 体細胞分裂; 減数分裂

本研究では新規に開発した精子形成の全過程（精原細胞から精子まで）を再現するメダカ細胞培養系を利用し、精子形成の制御機構の解明を目的として研究を実施した。特にleukemia inhibitory factor (LIF) の精子形成における機能に焦点を絞って研究を進めた。平成24年度の研究で、昆虫培養細胞Sf9で作製した機能的な組換えLIF蛋白質を培養系に添加する、あるいはLIFを強制発現させたメダカ精巣体細胞株をバキュロウイルスを用いた遺伝子導入法で作製し、これを細胞培養系においてフィーダー細胞として用いると精原細胞数が増加することが判った。この結果はLIFが精原細胞の増殖を促進することを示唆するが、精原細胞から精母細胞への分化がLIFによって抑制されている可能性も否定できない。平成25年度はLIFの精原細胞に対する効果をさらに詳細に解析するため、1）精原細胞を幹細胞型（タイプＡ）と分化型(タイプＢ）に区別する方法、2）標識した細胞を追跡することで培養系における細胞動態を解析する方法を検討した。その結果、1）新規に作製したゼブラフィッシュPiwi様蛋白質1に対する抗体はメダカホモログを認識してメダカ精原細胞のみを染め、さらにタイプＡ精原細胞をより強く染めるため、タイプＡの精原細胞とタイプＢの精原細胞を区別できること、2）細胞をＰＫＨ26で標識することで、その後の培養下での増殖・分化を追うことが可能であることが明らかとなった。これらの新しい実験ツールを用い、セルソーターで単離した精原細胞に富む細胞分画を様々な培養条件下で培養した結果、LIFはメダカ精原細胞の増殖・分化を制御することが明らかになった。

这项研究是使用新开发的Medaka细胞培养系统进行的，该系统重现了精子发生的整个过程（从精子症到精子），并旨在阐明精子发生的机理。该研究的重点是白血病抑制因子（LIF）在精子发生中的功能。 2012年的一项研究表明，当在昆虫培养细胞中产生的功能性重组LIF蛋白添加到培养系统中，或者使用基因转移使用杆状病毒转移并在细胞培养系统中用作喂食器细胞时，使用基因转移产生了LIF的Medaka睾丸体细胞系时，Spermatogonia的数量会增加。该结果表明，LIF促进了精子增生，但不能排除从精子细胞到精子细胞的区分被LIF抑制。在2013年，为了进一步分析LIF对精子的影响，我们研究了1）将精子分解为干细胞类型（A型）和分化（B型）的一种方法； 2）一种通过跟踪标记的细胞来分析培养系统中细胞动力学的方法。 As a result, it was revealed that 1) the newly produced antibody against the zebrafish Piwi-like protein 1 recognizes the medaka homolog and stains only medaka spermatogon cells, and also stains type A spermatogon cells more strongly, allowing the distinction between type A spermatogon cells and type B spermatogon cells, and 2) labeling the cells with PKH26 makes it possible to track随后的培养物下增殖和分化。使用这些新的实验工具，在各种培养条件下培养了使用细胞分散者分离的精子症的细胞级分，并且发现LIF调节了Medaka精子的增殖和分化。