生体膜脂質の疎水性部分を可視化する逆転凍結レプリカ脂肪酸標識法の開発

开发逆冷冻复制脂肪酸标记方法以可视化生物膜脂质的疏水部分

基本信息

批准号：
22KJ2527
负责人：
黒川夕奈
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kagoshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

現在まで、DNA・RNAと蛋白質の解析技術の飛躍的発展に伴い、多くの知見が集積している。しかしながら、脂質、特に生体膜脂質二重層の内側に局在する脂肪酸に関しては解析技術が少なく未知の点が多い。申請者らは急速凍結・凍結割断レプリカ標識（QF-FRL）法の開発によって膜脂質を特異的に標識することが可能となり、生体膜脂質の微細分布解明に成功した。しかしこのQF-FRL法が識別するのは膜脂質の“親水性頭部”の違いであるのに対し、 “疎水性尾部”の違いを明らかにできなかった。またQF-FRL法以外の方法によっても、疎水性尾部を標識することは困難であった。そこで本研究では、QF-FRL法の改良により逆転凍結レプリカ脂肪酸標識法を開発し、生体膜における脂肪酸分布をナノレベルで解析する。近年、脂肪酸の中でも不飽和脂肪酸が、様々な生理機能に影響することがわかってきた。しかしその機序は不明である。本研究では逆転凍結レプリカ脂肪酸標識法の開発によって、疾患及び疾患改善と、脂肪酸代謝及び摂取との関連の解明を目的としている。細胞培養中にアルキン化した脂肪酸を投与することにより培養細胞あるいは組織に取り込ませ、それぞれの脂肪酸が細胞のどの部位から取り込まれ、その後どういう経路をたどり最終的に細胞内のどの部位に局在するのかを明らかにし、各種脂肪酸が持つ生理活性発現機序の解明を目指す。前年度は、培養組織の培養液中にアルキン化不飽和脂肪酸を入れ細胞内に取り込ませ、そのアナログが本来の内在性脂質と同様の性質を持つことを確認し、クリックケミストリー法により不飽和脂肪酸を標識することに成功した。今年度は、急速凍結・凍結割断レプリカ標識（QF-FRL）法の改良と並行し、オレイン酸以外のリノレン酸、リノール酸、アラキドン酸など様々な種類の脂肪酸においても同様の標識局在検索を試みた。

迄今为止，由于DNA/RNA和蛋白质分析技术的快速发展，已经积累了大量的知识。然而，对于脂质，特别是位于生物膜脂质双层内的脂肪酸的分析技术很少，并且存在许多未知点。作者开发了快速冷冻-冷冻分数复制标记（QF-FRL）方法，使特异性标记膜脂成为可能，并成功阐明了生物膜脂的微观分布。然而，虽然这种 QF-FRL 方法区分了膜脂“亲水头”的差异，但它无法揭示“疏水尾”的差异。此外，通过QF-FRL方法以外的方法很难标记疏水尾部。因此，在本研究中，我们通过改进QF-FRL方法开发了一种反向冷冻复制脂肪酸标记方法，并在纳米水平上分析生物膜中的脂肪酸分布。近年来，人们发现脂肪酸中的不饱和脂肪酸影响多种生理功能。然而，其机制尚不清楚。本研究旨在通过开发反向冷冻复制脂肪酸标记方法来阐明疾病和疾病改善与脂肪酸代谢和摄入之间的关系。通过在细胞培养过程中给予烷基化脂肪酸，使其被摄取到培养的细胞或组织中，每种脂肪酸是从细胞的哪一部分摄取的，然后采取什么途径，最终在细胞的哪一部分中我们的目标是阐明各种脂肪酸的生物活性表达机制。去年，我们将炔基不饱和脂肪酸引入到培养组织的培养基中，并将其掺入细胞中，证实其类似物具有与原始内源性脂质相似的性质，并利用点击化学成功标记了不饱和脂肪酸。今年，在改进快速冷冻/冷冻断裂复制标记（QF-FRL）方法的同时，我们将对油酸以外的各种脂肪酸进行类似的标记定位搜索，例如亚麻酸、亚油酸酸和花生四烯酸我试过了。

项目成果

期刊论文数量（10）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Selective increment of phosphatidylserine on the autophagic body membrane in yeast’s vacuole.

酵母真空中自噬体膜上磷脂酰丝氨酸的选择性增量。

DOI：
10.1002/1873-3468.14167
发表时间：
2021
期刊：
FEBS Lett.
影响因子：
0
作者：
Yamakuchi;Y.;Kurokawa;Y.;Konishi;R.;Fukuda;K.;Masatani;T.;Fujita;A.
通讯作者：
A.

The distribution of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the budding yeast plasma membrane.

磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸在芽殖酵母质膜中的分布。

DOI：
10.1007/s00418-021-01989-8
发表时间：
2021
期刊：
Histochem. Cell Biol.
影响因子：
0
作者：
Kurokawa;Y.;Konishi;R.;Yoshida;A.;Tomioku;K.;Tanabe;K.;Fujita;A.
通讯作者：
A.

Essential roles of phosphatidylinositol 4-phosphate phosphatases Sac1p and Sjl3p in yeast autophagosome formation

磷脂酰肌醇4-磷酸磷酸酶Sac1p和Sjl3p在酵母自噬体形成中的重要作用

DOI：
10.1016/j.bbalip.2022.159184
发表时间：
2022
期刊：
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids
影响因子：
0
作者：
Muramoto Moe;Yamakuchi Yuki;Konishi Rikako;Koudatsu Shiomi;Tomikura Hiromu;Fukuda Kayoko;Kuriyama Sayuri;Kurokawa Yuna;Masatani Tatsunori;Tamaki Hisanori;Fujita Akikazu
通讯作者：
Fujita Akikazu

「急速凍結・凍結割断レプリカ標識（QF-FRL）法を用いた酵母細胞膜におけるPI(4,5)P2の局在解析による、PI(4,5)P2生成の制御機構の解明」

“使用快速冷冻/冷冻断裂复制标记 (QF-FRL) 对酵母细胞膜中的 PI(4,5)P2 进行定位分析，阐明 PI(4,5)P2 产生的控制机制”