EF-P改変による翻訳導入可能な非天然アミノ酸種の拡充

通过修饰 EF-P 扩展可翻译的非天然氨基酸种类

基本信息

批准号：
22KJ0865
负责人：
金山大輝
金额：
$ 1.09万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22KJ0865/
关键词：
試験管内翻訳翻訳伸長因子P 人工進化

项目摘要

本研究は、試験管内で翻訳導入可能な非天然アミノ酸種を拡充するため、翻訳伸長因子Pを人工進化することを目標としている。天然の翻訳伸長因子Pは、細菌中でプロリン連続配列の翻訳導入を促進する働きを持つが、再構成試験管内翻訳系においても一部の非天然アミノ酸の翻訳導入を促進あるいは抑制することが知られている。そこで、導入する非天然アミノ酸種に応じて翻訳伸長因子Pを最適化することで、導入可能な非天然アミノ酸種を拡充できると期待される。翻訳伸長因子Pは188残基のアミノ酸から構成されるタンパク質であるが、その中で最も翻訳反応に影響を及ぼすと考えられている、34残基目のアミノ酸に様々な変異を加えることとした。本年度はまず、天然アミノ酸のみで構成された翻訳伸長因子P変異体をモデルタンパク質として、発現系の構築に取り組んだ。発現系には、非天然アミノ酸を含んだ翻訳伸長因子P変異体ライブラリ構築に有利であると考えられる、大腸菌由来の試験管内翻訳系を採用した。既存の翻訳系では翻訳量が著しく低かったため、質量分析装置で翻訳産物を検出できなかった。そこで、各翻訳因子や核酸の濃度等を最適化することで、十分量の翻訳伸長因子Pを得ることに成功した。発現した翻訳伸長因子Pの濃縮・精製方法や、放射性ラベル化されたアミノ酸を用いた翻訳伸長因子Pの活性評価方法の検討も行った。現在は様々な非天然アミノ酸を含有した翻訳伸長因子Pの翻訳合成を行っている。

这项研究的目的是为了扩大可以在体外翻译的非天然氨基酸物种的人为发展的翻译伸长因子P。自然翻译伸长因子P具有促进细菌中脯氨酸连续序列的翻译引入的功能，但已知可以在重组的体外翻译系统中促进或抑制某些非天然氨基酸的转化引入。因此，可以预期，通过根据引入的非天然氨基酸物质优化翻译伸长因子P，可以扩展可以引入的非天然氨基酸物种。翻译伸长因子p是一种由188个氨基酸组成的蛋白质，在残基34处对氨基酸进行了各种突变，这被认为最大程度地影响了翻译反应。今年，我们首先使用仅由天然氨基酸作为模型蛋白组成的翻译伸长因子P突变体构建表达系统。表达系统是源自大肠杆菌的体外翻译系统，该系统被认为是构建含有不自然氨基酸的翻译伸长因子P突变库的优势。现有翻译系统中的翻译量显着较低，质谱仪无法检测到翻译产物。因此，通过优化每个翻译因子，核酸等的浓度，我们成功地获得了足够数量的翻译伸长因子。我们还研究了用于富集和净化表达的翻译伸长因子P的方法，以及用于评估使用放射标记的氨基酸的翻译伸长率P的活性的方法。当前，进行了含有多种非天然氨基酸的翻译伸长因子P的翻译合成。