コレラ菌走化性受容体のリガンド認識機構

霍乱弧菌趋化受体的配体识别机制

基本信息

批准号：
17J02169
负责人：
高橋洋平
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-26 至 2019-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究の目的は、細菌の走化性受容体を介したシグナル伝達機構の解明である。2017年度の私の研究において、感染症コレラの病原菌であるコレラ菌の毒素産生および走化性に関与する受容体Mlp24, Mlp37について、認識メカニズムの詳細やそれらの差異を明らかにした。私は本年度コレラ菌受容体Mlp8に着目した。Mlp8はアミノ酸配列の相同性から、Mlp24やMlp37と類似した構造をもつと考えられるが、それらとは認識する化学物質が異なる。またmlp8遺伝子はacfCとオペロンを形成することから、AcfCと協同してリガンドを認識すると考えられる。AcfCのリンゴ酸複合体構造は既知であり、ペリプラズム結合タンパク質（PBP）と良く似た構造をもつことが知られている。しかしリガンド非結合状態の構造は知られていないため、他のPBPと同様のメカニズムでMlp8と相互作用するかはわかっていない。私はAcfCリガンド非結合状態の構造解析に加えて、Mlp8のペリプラズム領域、AcfC、リガンドを用いた相互作用実験からMlp8のリガンド認識機構解明を目指した。AcfCリガンド非結合状態、リンゴ酸結合状態の構造を比較した結果、AcfCのリンゴ酸結合部位の表面電荷が、リンゴ酸結合により電気的中性にシフトすることがわかった。また相互作用実験の結果から、AcfCにリンゴ酸が結合することでAcfCとMlp8の親和性が上昇することがわかり、これはAcfCの表面電荷が関与していると考えられる。コレラ菌走化性受容体に加え、これまで様々な研究が行われ、研究地盤が確立しているサルモネラ走化性受容体Tarにも着目した。大腸菌発現系、DDMによる可溶化、Niアフィニティクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィを用いることで、Tarの全長構造解明の足がかりとなる単離生成に成功した。

本研究的目的是阐明细菌趋化受体介导的信号转导机制。在我2017年的研究中，我阐明了受体Mlp24和Mlp37的识别机制的细节以及它们之间的差异，这些受体参与霍乱弧菌（霍乱病原体）的毒素产生和趋化性。今年，我重点关注霍乱弧菌受体 Mlp8。基于氨基酸序列同源性，Mlp8被认为与Mlp24和Mlp37具有相似的结构，但它识别不同的化学物质。此外，由于mlp8基因与acfC形成操纵子，因此认为它与AcfC协同识别配体。 AcfC 的苹果酸复合物结构是已知的，并且已知其具有与周质结合蛋白（PBP）非常相似的结构。然而，由于其未配体状态下的结构未知，因此尚不清楚它是否通过类似于其他PBP的机制与Mlp8相互作用。除了对未配体状态的 AcfC 进行结构分析外，我还旨在通过使用 Mlp8 的周质区、AcfC 和配体的相互作用实验来阐明 Mlp8 的配体识别机制。比较未配体状态和苹果酸结合状态的 AcfC 结构表明，AcfC 苹果酸结合位点的表面电荷在苹果酸结合后转变为电中性。此外，相互作用实验的结果表明，苹果酸与AcfC的结合增加了AcfC和Mlp8之间的亲和力，这被认为与AcfC的表面电荷有关。除了霍乱弧菌趋化受体外，我们还重点研究了沙门氏菌趋化受体Tar，该受体已得到广泛研究，并已建立了研究基础。通过使用大肠杆菌表达系统、DDM增溶、Ni亲和层析和尺寸排阻层析，我们成功分离并生产了Tar，为阐明其全长结构提供了立足点。