ミニセルを用いた擬似細胞触媒システムの開発

使用微细胞开发拟细胞催化系统

• 批准号: 16K14496
• 负责人: 田代 洋平
• 金额: $ 2.5万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-01 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16K14496/
• 关键词: 合成生物学; 細胞分裂; ミニセル; 遺伝子回路; バイオ生産; 代謝工学; 生体機能利用; 発酵; 酵素; 応用微生物; バイオテクノロジー

本研究は、無核小細胞（ミニセル）を放出する遺伝子システムの構築、ミニセルにおける代謝経路の構築、ミニセルへの転写機能付加の3ステップから成る。現在、第1ステップのミニセルを放出する遺伝子システムの開発を行っている。２つのタイプのミニセル化システムに取り組んでいる。ひとつめは、遺伝子の過剰発現型システムである。実施者はminE、ftsA、そしてzipAの3つの遺伝子に注目し、minEおよびftsAが無水テトラサイクリン（aTc）によって誘導される遺伝子コンストラクトを作製した。zipAは、その毒性のため、他の遺伝子と同様のコンストラクトを構築できなかった。ふたつめは、遺伝子抑制型のシステムである。minCはZリング形成部位を規定するタンパク質のひとつである。minCの発現が不足すると、細胞の中心以外の不適切な場所でZリングが形成され、その結果、ミニセルが放出される。現在、ある化合物を培地に添加した時、minC発現が抑制されるような遺伝子コンストラクトを作製中である。作製したminEの過剰発現システム（minEプラスミド）を用いて、実際にミニセルが作られるか確認した。ミニセルの確認には、β-ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）をコードしたColE1型プラスミド（プローブプラスミド）を利用した。プローブプラスミド上のlacZの発現はゲノム由来のlacIによって抑制されている。ラクトース不在条件では、lacZは無核であるミニセルでのみ発現されるわけである。minEプラスミドおよびプローブプラスミドを大腸菌へ導入し、その機能を確認した。この実験で、ペレットのβ-ガラクトシダーゼ活性は、aTcによって優位に増大した。aTcはminEの発現を誘導するが、lacZの発現は直接的に誘導しないため、このシグナルの増大はプローブプラスミドを内包したミニセルが生産されたためだと考えられた。

这项研究包括三个步骤：构建释放小有核细胞（小细胞）的基因系统、构建小细胞中的代谢途径以及向小细胞添加转录功能。目前，我们正在开发一种遗传系统来释放小细胞，作为第一步。我们正在研究两种类型的小蜂窝系统。第一个是基因过表达系统。研究人员专注于三个基因：minE、ftsA 和 zipA，并创建了一个基因构建体，其中 minE 和 ftsA 由脱水四环素 (aTc) 诱导。由于其毒性，无法为 zipA 构建与其他基因类似的构建体。第二种是基因抑制系统。 minC 是定义 Z 环形成位点的蛋白质之一。 minC 表达的缺乏会导致 Z 环在细胞中心以外的不适当位置形成，从而导致小细胞释放。我们目前正在创建一种基因构建体，当将某种化合物添加到培养基中时，该基因构建体可以抑制 minC 表达。使用创建的minE过表达系统（minE质粒），我们确认了是否真的可以产生小细胞。使用编码β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的ColE1型质粒(探针质粒)来确认小细胞。探针质粒上 lacZ 的表达被基因组来源的 lacI 抑制。在没有乳糖的情况下，lacZ 仅在无核小细胞中表达。将minE质粒和探针质粒导入大肠杆菌并确认其功能。在此实验中，aTc 显着提高了沉淀的 β-半乳糖苷酶活性。由于 aTc 直接诱导 minE 而不是 lacZ 的表达，因此信号的增加被认为是由于含有探针质粒的小细胞的产生。