Establishment of a functional screening method for disease susceptible variants in arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy.

建立致心律失常性右心室发育不良/心肌病疾病易感变异的功能筛查方法。

• 批准号: 18K15844
• 负责人: 和田 悠子
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Shiga University of Medical Science
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-01 至 2020-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18K15844/
• 关键词: 不整脈; 心筋症; 遺伝子; 多型; 遺伝子多型; デスモゾーム; 不整脈源性右室心筋症; 遺伝子変異

目的①-[1] マウスDsg2によって維持される細胞接着性を検証する、[2] Dsg2多型D494A発現細胞では細胞間分布密度が減少している、[3] Dsg2安定発現細胞を用いた、細胞間接着密度と強度の定量評価。（目的①[1]~[3]の成果）Dsg2非発現細胞（非ヒト細胞）に異種強制発現させた場合、変異型デスモグレイン2(以下Dsg2)を介する細胞間接着の緊密性が乏しいことを示した。目的①-[3]について、デスモグレイン2蛋白の安定発現細胞株の取得に時間を要している。従来のトランスフェクション-選択抗生剤を用いる手法ではチャイニーズハムスター卵巣細胞での安定発現は得られなかったため、ウイルス感染を介した安定発現株取得を目指し、学内の遺伝子組み換え実験の申請手続きを行った（施設内認定に2ヶ月を要した）。目的②[4] Fc-Dsg2分子を用いたDsg2の細胞間接着機能スクリーニング。（目的②の成果）未着手である。目的③[5] Dsg2と相互作用しうる候補蛋白の同定と機能解析。（目的③[5]の成果）Dsg2と相補的に結合しうる未知の蛋白の検出は、マウス心筋サンプル内に存在すると想定し、大腸菌体内で作成したGST融合型Dsg2をbait(餌)にしてpull downし、TOF-MSを複数回行ったが、質量分析過程でノイズ値が高く、候補蛋白の絞り込みは出来なかった。十分量のマウス心筋サンプルを用いたにも関わらず、Dsg2と相補的に結合しうる未知の蛋白が検出されない原因として、①Dsg2が何ものとも協同していない、②協同しているが、結合の達成に糖鎖が関与しているために、大腸菌体内で作成したGST融合型Dsg2とは結合できない、可能性を考えた。②は、ヒト由来培養細胞を用いて分泌型蛋白を回収し、糖鎖を保存して蛋白を大量精製することで達成可能性がある。

目的① - [1]验证小鼠Dsg2维持的细胞粘附，[2]表达Dsg2多态性D494A的细胞细胞间分布密度降低，[3]使用稳定表达Dsg2的细胞，定量评价细胞间粘附密度和强度。 （目标1[1]至[3]的结果）当在非表达细胞（非人细胞）中强制表达异源Dsg2时，由突变桥粒芯糖蛋白2（以下简称Dsg2）介导的细胞与细胞粘附的紧密度很差。关于目标1-[3]，获得稳定表达桥粒芯糖蛋白2蛋白的细胞系需要时间。由于传统的抗生素转染选择方法无法在中国仓鼠卵巢细胞中获得稳定表达，因此我们申请了校内基因重组实验，旨在通过病毒感染获得稳定表达株（历时两个月）待认证的设施）。目的②[4]利用Fc-Dsg2分子筛选Dsg2的细胞间粘附功能。 （目标2的结果）尚未开始。目的③[5]与Dsg2相互作用的候选蛋白的鉴定及功能分析。 （目标3的结果[5]）假设存在于小鼠心肌样本中，使用大肠杆菌中产生的GST融合Dsg2作为诱饵，进行了与Dsg2互补结合的未知蛋白质的检测。 TOF-MS多次，但质谱过程中噪声值较高，无法缩小候选蛋白范围。尽管使用了足够量的小鼠心肌样本，但未检测到能够与Dsg2互补结合的未知蛋白的原因是：（1）Dsg2不与任何物质合作；（2）虽然它合作，但结合我们考虑了可能性。由于糖链参与实现这一目标，因此它无法与大肠杆菌中产生的 GST 融合 Dsg2 结合。 ②可以通过使用人源培养细胞收集分泌蛋白、保留糖链并大量纯化蛋白来实现。