Rett症候群における新規のエピジェネティックな生理活性物質産生メカニズムの解明

阐明雷特综合征中新型表观遗传生物活性物质产生机制

• 批准号: 18K07851
• 负责人: 入江 理恵
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Kagoshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2018
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2018-04-01 至 2021-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18K07851/
• 关键词: Rett症候群; mecp2; RNAi; 脳・神経; 脳・神経疾患; 細胞・組織; 生理活性; 解剖学; 超微形態学; 発生学; 脳・神経学; 形態形成

雄のmecp2遺伝子欠損マウス(mecp2-/y)で得られた生理活性物質の変化を、in vitroにて安定的に再現できる細胞株を作製することができた。方法としては、shRNA-mecp2を搭載したレンチウィルスベクター感染によるRNAi法により候補組織の培養細胞においてmecp2遺伝子ノックダウンを行い、細胞分取によりmecp2遺伝子ノックダウン細胞の純化株を作製し、生体で見られた現象を再現することを可能とした。純化株を増殖させてストックした後、継代数を合わせて実験を行うことで、非常に安定的な実験を行うことができた。現在このmecp2ノックダウン細胞でこの物質の生合成経路に関係する遺伝子群、あるいはそのプロモーター領域を網羅的に分子生物学的手法(定量PCR、Western blottingなど)にて確認中である。さらに上述に加え、mecp2遺伝子の発現レスキュー実験に着手し、内因性mecp2のノックアウト及び外因性mecp2発現レンチウィルスベクター(mecp2遺伝子の置き換えベクター)を構築し導入させて、上記と同種の細胞に感染させライン化を試みた。しかしながら、mecp2遺伝子を高発現させることにより細胞の増殖に影響が見られたため、こちらについては未だ細胞を安定して使用できていない状況である。今後なんとか改良し、細胞株を安定化させ、mecp2発現とそれに伴う上記生理活性物質の生合成経路に関する遺伝子群の発現変動を評価する予定である。さらに、in vitroの系でmecp2ノックダウン細胞からTotal RNAを抽出し、マイクロアレイ解析(mRNAおよびmiRNA発現解析)とデータマイニングを行うための準備を進めている。また、ChIPシークエンスを実施し、MeCP2蛋白とゲノ全体のDNA結合部位を同定することにより、MeCP2蛋白の結合遺伝子を確定させ、対象細胞における産生物質合成経路の遺伝子制御ネットワークを解明するための計画・準備を行っている。

我们能够创建一种细胞系，该细胞系可以在体外稳定地重现在雄性 mecp2 基因缺陷小鼠 (mecp2-/y) 中获得的生理活性物质的变化。该方法通过感染携带shRNA-mecp2的慢病毒载体，使用RNAi方法敲低候选组织的培养细胞中的mecp2基因，并通过细胞分选创建纯化的mecp2基因敲低细胞系，从而可以重现该现象。观察到这一点。在对纯化菌株进行繁殖和储存后，我们能够通过调整传代次数来进行极其稳定的实验。我们目前正在利用分子生物学方法（定量PCR、Western blotting等）全面确认mecp2敲低细胞中与该物质生物合成途径相关的基因及其启动子区域。此外，除上述之外，我们还开始了mecp2基因的表达拯救实验，构建并导入了敲除内源mecp2并表达外源mecp2的慢病毒载体（mecp2基因置换载体），以及与上述相同类型的感染细胞我试着把它变成一条线。然而，由于mecp2基因的高表达影响细胞增殖，该细胞尚未稳定使用。未来，我们计划以某种方式改进这一点，稳定细胞系，并评估与mecp2表达相关的基因表达的变化以及上述生理活性物质的生物合成途径。此外，我们正准备使用体外系统从mecp2敲低细胞中提取总RNA，并进行微阵列分析（mRNA和miRNA表达分析）和数据挖掘。此外，通过ChIP测序和鉴定MeCP2蛋白与整个基因组的DNA结合位点，我们确定了MeCP2蛋白的结合基因，并建立了阐明MeCP2蛋白合成途径的基因调控网络的计划。目标细胞的准备工作正在进行中。