新規雌性尿中生理活性物質の分離精製と中枢神経系内活性化部位の同定

女性尿液中新型生理活性物质的分离纯化及中枢神经系统激活位点的鉴定

• 批准号: 19K06943
• 负责人: 阿久津 仁美
• 金额: $ 2.83万
• 依托单位: Iwate Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K06943/
• 关键词: ラット; 雌性フェロモン; 鋤鼻感覚細胞; 行動観察; 中枢神経; 最初期遺伝子; 免疫組織化学; フェロモン; 尿中生理活性物質; 脳; 雌ラットフェロモン; カルシウムイメージング; バイオアッセイ; 鋤鼻器; 免疫染色

申請者らがこれまでに確認している「雌ラット尿中生理活性物質が雄ラット鋤鼻感覚細胞に細胞内カルシウムイオン濃度の特異的上昇を引き起こす」現象を、個体の行動的反応と中枢神経活動から検証するため、雌ラット尿に直接接触できる環境に雄ラットを導入しtて、尿に対する探索行動を観察し、その持続時間を計測した。成熟雄ラット（週齢11‐16週）を、紙製床敷を入れた行動観察用ケージ（透明アクリル製：60x45x45cm）に入れ、30分間馴化させた。このケージの四角には紙製のマウス用巣（シェファードシャックドーム型：SSP社製）を半切したものを紙テープで固定し、内部にはキムワイプを入れた。マウス用の巣は、ラットが頭部のみを内部に入れられるサイズである。馴化後、1か所の巣内キムワイプには雌ラット尿（発情前期尿、発情休止期尿）希釈液（2倍希釈）を400ul、その他3か所の巣内キムワイプには希釈に使用した生理的食塩水を400ulしみこませ、ラットの行動を30分間観察・記録した。ラットが周囲環境の匂いなどを受容して発生した神経活動のコントロール群として、尿希釈液を用いずに生理的食塩水のみを暴露した実験も行った。30分の馴化でケージ内の環境に慣れたラットは、尿希釈液を巣に注入されるとその匂いに対して反応を示し、匂いを嗅ぐ探索行動を示した。探索行動は発情前期尿（P尿）と発情休止期尿（D尿）の両者に対して顕著に発現し、その持続時間はP尿：283.12±75.33秒、D尿：247.76±79.26秒で、両者間に有意な差異は見られなかった（P尿群、D尿群ともにn=6）。行動観察後、尿暴露から1時間半経過した時点で、安楽死させて全身灌流固定し、鋤鼻器を含む吻部と脳を採材して、吻部は後固定、脱灰処理後に耐凍結処理をしてコンパウンド包埋、脳は後固定と耐凍結処理をしてコンパウンド包埋した。

申请人和他的同事迄今为止已经证实了“雌性大鼠尿液中的一种生理活性物质会导致雄性大鼠犁鼻感觉细胞的细胞内钙离子浓度特异性增加”的现象。为了验证该活性，我们引入了雄性大鼠将大鼠置于可直接接触雌性大鼠尿液的环境中，观察其对尿液的探索行为，并测量探索行为的持续时间。将成年雄性大鼠（11-16周龄）置于铺有纸垫的行为观察笼（由透明丙烯酸制成：60 x 45 x 45 cm）中，并使其适应30分钟。用纸胶带将半切的纸鼠窝（Shepherd Shack圆顶型，SSP制造）固定在该笼子的正方形上，并在里面放置Kimwipe。老鼠巢足够大，老鼠只能把头放进去。驯化后，将400ul雌性大鼠尿液（发情前期尿、发情间期尿）稀释液（2倍稀释）加入到一窝Kimwipe中，将稀释用的生理盐水加入到另外三窝Kimwipe 400ul生理盐水中。将其浸泡到容器中，观察并记录大鼠的行为30分钟。作为大鼠在周围环境中接收气味时发生的神经活动的对照组，我们还进行了一项实验，在该实验中，它们仅接触生理盐水，而不使用稀释的尿液。经过30分钟的适应，老鼠逐渐习惯了笼子环境，当稀释的尿液注入它们的巢穴时，它们会对气味做出反应，并表现出探索性的嗅探行为。探查行为在发情前期尿（P尿）和发情间期尿（D尿）中均显着表达，其持续时间P尿为283.12±75.33秒，D尿为247.76±79.26秒，两组之间没有观察到显着差异。 （P尿组和D尿组n=6）。行为观察后，尿液暴露后1个半小时，将动物安乐死，全身灌注并固定。对包括犁鼻器和大脑的口鼻部进行取样，将大脑冷冻并包埋在复合物中。经过后固定和防冻并嵌入化合物中。