視床下部性性腺機能抑制における視索前野領域ミクログリアの役割の証明

证明视前区小胶质细胞在抑制下丘脑性腺功能中的作用

• 批准号: 19K09836
• 负责人: 藤岡 仁美
• 金额: $ 2.83万
• 依托单位: St. Marianna University School of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K09836/
• 关键词: GnRH; ミクログリア; ストレス; Kisspeptin; 機能性視床下部生性腺機能低下

本年度は、昨年度に問題となったミクログリアへの低遺伝子導入効率を改善するため、AAVセロタイプの検討を行った。AAV-CAG-GFPをLE-Tg(OTTC1005) CX3CR1-Cre-ERT2ラット（ミクログリア/Mφ系細胞でタモキシフェン誘導によりCreリコンビナーゼが活性化する組換え遺伝子をラット）の線状体にAAV-CAG-GFPを投与したサンプルを用いて、ミクログリアのマーカータンパク質であるIba1に対する抗体で免疫染色を行い、ミクログリアにおけるGPFの発現を検討した。その結果、検討を行ったすべてのAAVセロタイプ（AAV-1, AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-6.2, AAV-7, AAV-8）において、Iba-1陽性細胞でGFPの発現は観察されなかった。また、ミクログリアへの遺伝子導入が報告(Rosario et al, Mol Ther Methods Clin Dev. 2016, 3, 16026.)されているAAVTM6- Iba1-mCherry-DIO-DTAをAAV-CAG-GFPについても検討を行ったが、mCherryの発現はミクログリアでは観察されなかった。原因として、ミクログリアに組換え遺伝子が導入されていない可能性、組換え遺伝子は導入されているがコピー数が少なく発現が弱い可能性などが考えられる。本年度に入りOkadaら(Commun Biol, 2022, 5, 1224)がAAV9を用いて、Linら(Nat Methods, 2022, 19, 976-985)がAAV.MG1.1, MG1.2セロタイプを用いて、マウスのミクログリアへの高率の遺伝子導入を報告した。来年度は、これらAAVセロタイプによるミクログリアへの遺伝子導入をラットで検討する予定である。

今年，我们研究了AAV血清型，以改善去年存在的小胶质细胞基因转移效率低的问题。将 AAV-CAG-GFP 导入 LE-Tg(OTTC1005) CX3CR1-Cre-ERT2 大鼠（具有在小胶质细胞/Mφ 谱系细胞中经他莫昔芬诱导后激活 Cre 重组酶的重组基因的大鼠）的纹状体中 GPF 在小胶质细胞中的表达。使用 GPF 施用的样本，通过 Iba1（小胶质细胞标记蛋白）的抗体进行免疫染色进行研究。结果，在所有检查的AAV血清型（AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-6.2、AAV-7、AAV-8）中，在Iba-1阳性细胞中检测到GFP。观察到表达。我们还研究了 AAVTM6-Iba1-mCherry-DIO-DTA 和 AAV-CAG-GFP，据报道它们被引入小胶质细胞中（Rosario 等人，Mol TherMethods Clin Dev. 2016, 3, 16026）。在小胶质细胞中未观察到表达。可能的原因包括重组基因尚未导入小胶质细胞，或者重组基因已导入但拷贝数较少，表达较弱。今年，Okada 等人 (Commun Biol, 2022, 5, 1224) 使用了 AAV9，Lin 等人 (NatMethods, 2022, 19, 976-985) 使用了 AAV.MG1.1、MG1.2 血清型。基因转移到小鼠小胶质细胞的比率很高。明年，我们计划使用这些 AAV 血清型在大鼠中研究基因转移到小胶质细胞中。