安定同位体標識アミノ酸を用いた質量分析計による薬剤耐性菌検出法の確立

稳定同位素标记氨基酸质谱耐药菌检测方法的建立

• 批准号: 19K08927
• 负责人: 渡 智久
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Kameda University of Health Sciences
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K08927/
• 关键词: MALDI-TOF MS; SILAC; 薬剤耐性菌

近年提唱されている安定同位体標識法を前処理に利用するSILAC法は、抗菌薬原末の使用による煩雑な操作や薬剤耐性の判定が目視であることに課題がみられ、臨床現場での実用化に至っていない。本研究では、①SILAC法に薬剤ディスクを使用して簡便化を図ること,②SILAC法で処理した臨床由来の薬剤耐性株のマススペクトルをリファレンスライブラリーに登録することの2つによって、薬剤耐性菌の検出の自動判定を可能にすることを目的としている。臨床分離株の測定では、MSSA株を高率に識別できるが、MRSA株の判定能が低確率であるという課題が残されていたため、解析方法の変更を検討することとした。当初のMRSAのマススペクトルのリファレンスライブラリーへの登録による自動判定を中止し、ブルカー社のCliniProtools 3.0を使用し、薬剤耐性菌の判定法を確立できるかを検討することとした。培養液①Normal（通常のアミノ酸含有培地）、培養液②Heavy（安定同位体含有培地）、培養液③Heavy（安定同位体含有培地）＋薬剤ディスクの3種類の培養液で処理したMRSAのマススペクトルをCliniProtools 3.0のGenetic Algorithm（GA）、Supervised Neural Network（SNN）およびQuick Classifier（QC）の各統計処理によってクラスタリングを行ったが、培養液①と培養液②のマススペクトルはMSSAとMRSAでは大きな相違がみられないため、培養液③についてのみMSSAとMRSAをクラスタリングし、unknownなS. aureusがMSSAとMRSAのどちらに分類されるかを検討すれば良いということが判明した。

近年来提出的采用稳定同位素标记进行预处理的SILAC方法，由于使用抗菌药物散装粉末以及目视判断耐药性，存在操作复杂的问题，难以在临床使用。目前尚未投入实际使用。在本研究中，我们的目标是通过以下方式识别耐药细菌：(1) 使用药物盘简化 SILAC 方法，以及 (2) 在参考库中记录经 SILAC 方法处理的临床衍生耐药菌株的质谱。目的是实现检测的自动判断。在临床分离株的测定中，MSSA菌株的鉴定率较高，但对MRSA菌株的鉴定能力仍然较低，因此我们决定考虑改变分析方法。我们决定通过将 MRSA 质谱注册到参考库中来停止最初的自动测定，而是决定使用布鲁克的 CliniProtools 3.0 来检查是否有可能建立一种确定耐药细菌的方法。 CliniProtools显示了用三种培养基处理的MRSA的质谱：培养液①Normal（含正常氨基酸的培养基）、培养液②Heavy（含稳定同位素的培养基）、培养液③Heavy（含稳定同位素的培养基）+ 3.0 中的遗传算法 (GA)、监督神经网络 (SNN) 和 Quick使用Classifier(QC)的各统计处理进行聚类，但由于培养液①和培养液②的质谱中MSSA和MRSA没有大的差异，因此仅对培养液③进行了聚类。指出我们需要考虑未知的金黄色葡萄球菌是否被归类为 MSSA 或 MRSA。

项目成果

安定同位体標識アミノ酸を用いた質量分析計による MRSAの検出に関する研究

使用稳定同位素标记氨基酸的质谱仪检测 MRSA 的研究

• 发表时间: 2023
• 作者: 秀川智春;國下洋輔;吉見竜介;櫻井菜月;三橋正季;杉山裕美子;岸本大河;飯塚友紀;小宮孝章;永井秀人;濱田直樹;土田奈緒美;副島裕太郎;神山玲光;小林幸司;浅見由希子;桐野洋平;矢嶋宣幸;佐田憲映;一瀬邦弘;大野滋;中島秀明;佐藤 真央
• 通讯作者: 佐藤 真央