新規スフィンゴ糖脂質プローブの創製による細胞膜ナノドメインの分子基盤解明

通过创建新型鞘糖脂探针阐明细胞膜纳米结构域的分子基础

基本信息

批准号：
19J10858
负责人：
浅野早知
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Gifu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

二年目は、一年目に開発した光反応性基「セレノフェン-2-イル置換型α-ケトアミド」の特性評価及びスフィンゴ糖脂質プローブへの応用に注力し、以下の研究項目を実施した。1. 新規光反応性基「セレノフェン-2-イル置換型α-ケトアミド」の開発モデル化合物であるα-マンノースアナログを用い、1H NMRを用いた水中におけるケトアミド構造の安定性評価、高速液体クロマトグラフィーを用いた光分解速度の解析を行い、従来型のチオフェン型構造と同等の水中安定性、光安定性を有することを示した。また、コンカナバリンAレクチンを用いたタンパク質親和性を等温滴定型カロリメトリーにより評価したところ、水素結合やファンデルワールス相互作用に基づく特異性の高い相互作用を示し、ケトアミド構造の導入によりタンパク質との親和性を妨げないことが示された。これらの結果を踏まえ、コンカナバリンAの光アフィニティラベル化を行い、標識化効率をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認したところ、高い標識化効率及び高選択的ラベル化を達成した。以上の結果より、セレノフェン-2-イル置換型α-ケトアミド構造は光反応性基として有用である可能性が示唆された。2. 光親和性GM3プローブの合成と細胞膜におけるラフト親和性タンパク質との光架橋実験一年目に合成した、シアル酸9位アミノ基修飾型GM3骨格並びに、アルキン及び前述の光反応性基を有する光反応性基ユニットを用い、両者をカルバメート結合を介してカップリングし、光親和性GM3プローブの合成を達成した。A549細胞を用いた光架橋、アジド-アルキン環化付加反応によるビオチンタグの導入、ストレプトアビジンカラムを用いたGM3-標的タンパク質複合体のアフィニティ精製、プロテオミクス解析を行い、17種類の親和性タンパク質候補が同定された。

第二年，我们重点对第一年开发的光反应基团“硒酚-2-基取代的α-酮酰胺”进行表征并将其应用于鞘糖脂探针，开展了以下研究项目。 1. 使用 α-甘露糖类似物，使用 1H NMR 和高效液相色谱法评估酮酰胺结构在水中的稳定性，α-甘露糖类似物是开发新光反应基团“硒酚-2-基取代的 α-”的模型化合物我们分析了噻吩型结构的光降解率，结果表明它具有与传统噻吩结构相同的水中稳定性和光稳定性。此外，当通过等温滴定量热法评估使用伴刀豆球蛋白A凝集素的蛋白质亲和力时，发现基于氢键和范德华相互作用的相互作用具有高度特异性，并且酮酰胺结构的引入表明与蛋白质的亲和力已表明它不会干扰。基于这些结果，我们对伴刀豆球蛋白A进行了光亲和标记，并通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳确认了标记效率，发现我们实现了高标记效率和高选择性标记。上述结果表明，硒代酚-2-基取代的α-酮酰胺结构可用作光反应基团。 2.光亲和GM3探针的合成及与细胞膜亲水蛋白的光交联实验第一年合成，唾液酸9位氨基修饰的GM3骨架，含有炔烃和上述光反应基团使用光反应基团单位，两者通过氨基甲酸酯键偶联，合成了光亲和GM3探针。我们使用A549细胞进行光交联，通过叠氮-炔环加成反应引入生物素标签，使用链霉亲和素柱对GM3-靶蛋白复合物进行亲和纯化，以及蛋白质组分析，鉴定出17种亲和蛋白候选物。