時空間相関イメージングによる細胞内遺伝子デリバリー機構の全容解明

通过时空相关成像完整阐明细胞内基因传递机制

• 批准号: 19K06590
• 负责人: 佐々木 章
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K06590/
• 关键词: 画像相関分光法; 顕微鏡ベンチマーク; 定量イメージング; 蛍光相関解析; 遺伝子デリバリー

本研究では、レーザー共走査型共焦点顕微鏡のタイムラプス測定画像(生データ)を取得し、分子拡散由来のシグナル(蛍光強度揺らぎ)とオルガネラ等の構造体の シグナルを分離した状態において、画像相関法等を用いて、通常のイメージングにおける蛍光強度分布の情報に加えて、共局在度、構造体の移動方向、核酸分子 の分解度、 DNA認識タンパク質との相互作用、分子数、複合体形成のような高次情報を抽出し、さらにそれらの情報を統合することを目的としている。 また、細胞内に導入されたDNA分子の分解をターゲットとし分解に関与する因子の同定や機能解明を目指している。 昨年度は時空間相関イメージングの基礎となる画像相関法の基盤技術の検討を行った。具体的には、画像相互相関法(Image cross-correlation spectroscopy) の原理により、画像の共局在性を定量的に解析する方法について検討した。試料として、任意の距離を隔てて2色で蛍光標識されたDNAオリガミ分子を設計し、 標識間の相関を定量化して2色間の共局在性を判別する技術を構築した。画像相関を実施する際に必須となる、顕微鏡の正しい調整やキャリブレーションに使用する標準試料に関する情報をまとめた総説論文を発表した。また、本技術をDNAのみならず細胞内のRNAに展開していくための技術として、蛍光アプタマーを活用 した蛍光相関解析の検討を行った。蛍光RNAアプタマーであるBroccoliと蛍光基質(DFHBI-1T)の結合解離やそれによる蛍光強度の増大、蛍光相関測定への適用 における基本的性質の検証などを行い、論文成果を得た。今年度は、画像相関の技術開発を継続するとともに、その基礎技術が顕微鏡のハードウェア性能などを定量評価することに適していることを見出し、招待講演並びにCommentary論文を発表した。

在本研究中，我们使用激光共扫描共聚焦显微镜获取延时测量图像（原始数据），并使用图像相关方法分离来自分子扩散的信号（荧光强度波动）和来自细胞器等结构的信号。除了正常成像中的荧光强度分布信息、共定位程度、结构的运动方向、核酸分子的分解程度、目的是提取高阶信息，例如与 DNA 识别蛋白的相互作用、分子数量和复合物形成，并进一步整合这些信息。 我们还针对引入细胞中的 DNA 分子的降解，旨在确定参与降解的因素并阐明其功能。 去年我们研究了图像相关法的基本技术，这是时空相关成像的基础。具体来说，我们研究了一种基于图像互相关光谱原理定量分析图像共定位的方法。作为样本，我们设计了用任意距离间隔的两种颜色进行荧光标记的 DNA 折纸分子，并开发了一种技术来量化标记之间的相关性并确定两种颜色之间的共定位。我们发表了一篇评论论文，总结了用于正确调整和校准显微镜的标准样品的信息，这在执行图像相关性时至关重要。此外，我们还研究了使用荧光适体的荧光相关分析技术，将该技术不仅扩展到DNA，还扩展到细胞中的RNA。我们通过验证荧光RNA适体西兰花和荧光底物（DFHBI-1T）的结合和解离、由此产生的荧光强度的增加以及应用于荧光相关测量的基本特性，获得了论文结果。今年，我们继续发展图像相关技术，发现该基础技术适合定量评估显微镜的硬件性能，并发表了邀请报告和评论论文。

项目成果

Fluorescence correlation methods for standardization of confocal fluorescence microscopy images

用于标准化共焦荧光显微镜图像的荧光相关方法

• 发表时间: 2022
• 作者: Akira Kawanabe;Maki Takata and Yuichiro Fujiwara;Sasaki Akira
• 通讯作者: Sasaki Akira

Toward traceable quantitative fluorescence microscopy - Benchmarking microscope using FCS technique -

迈向可追踪定量荧光显微镜 - 使用 FCS 技术的基准显微镜 -

• 发表时间: 2022
• 作者: 辻 明宏;山下 隼人;久冨 修;阿部 真之;Sasaki Akira
• 通讯作者: Sasaki Akira

蛍光相互相関分光法による蛍光アプタマーの分子特性計測

荧光互相关光谱法测量荧光适体的分子特性

• 发表时间: 2022
• 作者: 佐々木章;古旗祐一
• 通讯作者: 古旗祐一

Recent advances in the standardization of fluorescence microscopy for quantitative image analysis

• DOI: 10.1007/s12551-021-00871-0
• 发表时间: 2022-02-01
• 期刊: BIOPHYSICAL REVIEWS
• 作者: Sasaki, Akira

Monitoring Molecular Properties of a Fluorescence Light-Up Aptamer Using Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy

使用荧光互相关光谱监测荧光发光适体的分子特性

• DOI: 10.3390/app12042002
• 发表时间: 2022
• 期刊: Applied Sciences
• 作者: Furuhata Yuichi;Sasaki Akira
• 通讯作者: Sasaki Akira