長鎖クモ糸タンパク質遺伝子の利用による高強度シルクの創出

利用长链蜘蛛丝蛋白基因创造高强度丝

• 批准号: 19H02528
• 负责人: 小島 桂
• 金额: $ 11.15万
• 依托单位: National Agriculture and Food Research Organization
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19H02528/
• 关键词: 遺伝子組換えカイコ; クモ縦糸; オニグモ; cDNAクローニング; 力学物性; クモ糸シルク; 遺伝子組み換えカイコ; 縦糸タンパク質; ｃDNAクローニング; クモ糸

本年度は昨年度に引き続き、オニグモ、コガネグモからの糸関連遺伝子のクローニングと、遺伝子組換えカイコの作出、及び、遺伝子組換えカイコの系統化・糸サンプル調製を進めた。遺伝子クローニングについては、茨城県つくば市においてオニグモ（Araneus ventricosus)成体を屋外採取し、糸腺組織を採取してmRNA調整ののち縦糸タンパク質遺伝子に特異的なプライマーを用いて逆転写し、最適化したSMART法にしたがって、テンプレートスイッチから2nd strand cDNA合成したのち、In-Fusion法により発現ベクターへのcDNAのディレクショナルクローニングを行った。cDNAクローニングから、コロニーハイブリダイゼーションによるクモ糸タンパク質遺伝子を含むクローンの選抜を繰り返し、得られたクローンの得られたクローンのうち、長鎖のものから順にナノポアシーケンサによる配列確認を行い、タンパク質遺伝子として問題無い配列の選抜を行った。遺伝子クローニングについては、昨年度以上の大きさの遺伝子の取得には至らなかった。遺伝子組換えカイコの作出では、オニグモについて3種（MaSp1, MaSp2, MaSp3)を持つ遺伝子組換えカイコの作出に成功し、それぞれ系統化を進めた。

今年，我们继去年的基础上，继续开展东方蜘蛛和金蛛丝相关基因的克隆、转基因蚕的生产、转基因蚕的系统学和蚕丝样品的制备等工作。对于基因克隆，在茨城县筑波市户外收集腹腹蛛成虫，收集丝腺组织，进行mRNA调整后，使用warp蛋白基因特异的引物进行逆转录，并优化SMART后合成2nd。根据该方法从模板开关获取链 cDNA，使用 In-Fusion 方法将 cDNA 定向克隆到表达载体中。从cDNA克隆中，通过菌落杂交反复选择含有蜘蛛丝蛋白基因的克隆，并使用纳米孔测序仪按长度降序确认所获得的克隆的序列，我们选择了不存在的序列。关于基因克隆，我们无法获得比去年更大的基因。在转基因蚕的生产方面，我们成功地培育了东方蜘蛛的三个物种（MaSp1、MaSp2和MaSp3）的转基因蚕，并进行了每个物种的系统学研究。