GH30 β-1,6-グルコシダーゼの構造機能解析と有用糖質合成への応用

GH30 β-1,6-葡萄糖苷酶的结构和功能分析及其在有用碳水化合物合成中的应用

基本信息

批准号：
19K05826
负责人：
磯野直人
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Mie University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

Caldicellulosiruptor bescii由来β-1,6-グルコシダーゼ(CbGH30_1)の結晶化条件の最適化を行った。また、同条件において、本酵素の生成物であるグルコースとの複合体の結晶化も行った。X線回折装置を用いて各結晶からの回折強度データを測定した。すでに明らかにされているSalmonella typhimurium由来GH30タンパク質SrfJの構造をモデルとした分子置換法により位相決定を行い、分解能約2オングストロームで構造を決定した。CbGH30_1は他のGH30酵素と同様にTIMバレル構造を持つことが明らかとなった。酵素-生成物複合体において、グルコースはサブサイト-1の位置に結合していると予想された。ラミナリビオース、α-グルコシルフルオリド、α-グルコース 1-リン酸を基質として、HhGH30Aのグライコシンターゼと、Ochromonas danica由来β-1,3-グルカンホスホリラーゼ（β-1,3-グルカン伸長酵素）の反応を同時に行った。その結果、直鎖β-1,3-グルカンの沈殿（α-グルコース 1-リン酸を基質としたβ-1,3-グルカンホスホリラーゼのみの反応で生じる）は生じず、水溶性の多糖が合成された。生成した多糖をエタノール沈澱で回収し、メチル化分析により構造を解析した。その結果、水溶性多糖はβ-1,6-グルコシド結合による分岐を有するβ-1,3-グルカン（β-1,3-1,6-グルカン）であることが明らかとなった。また、この水溶性多糖のグルコース重合度をサイズ排除HPLCで分析したところ、数平均重合度が35、重量平均重合度が56と計算された。

我们优化了源自 Caldicellulosiruptor bescii 的 β-1,6-葡萄糖苷酶 (CbGH30_1) 的结晶条件。此外，在相同条件下，与该酶的产物葡萄糖的复合物结晶。使用 X 射线衍射仪测量每个晶体的衍射强度数据。采用分子置换法进行相位测定，该方法模仿了已经揭示的鼠伤寒沙门氏菌来源的GH30蛋白SrfJ的结构，并以约2埃的分辨率确定了结构。研究表明，CbGH30_1 与其他 GH30 酶一样具有 TIM 桶状结构。在酶-产物复合物中，葡萄糖预计结合在 subsite-1 位置。 HhGH30A 糖合酶和源自 Ochromonas danica 的 β-1,3-葡聚糖磷酸化酶（β-1,3-葡聚糖延伸酶）使用昆布二糖、α-葡萄糖基氟化物和 α-葡萄糖 1-磷酸作为底物同时进行反应。结果，不会发生线性β-1,3-葡聚糖（由β-1,3-葡聚糖磷酸化酶单独使用α-葡萄糖1-磷酸作为底物反应产生）的沉淀，并且水溶性多糖被已经合成了。通过乙醇沉淀回收产生的多糖，并通过甲基化分析对其结构进行分析。结果表明，水溶性多糖是由于β-1，6-葡萄糖苷键而具有支链的β-1，3-葡聚糖(β-1，3-1，6-葡聚糖)。此外，当通过尺寸排阻HPLC分析该水溶性多糖的葡萄糖聚合度时，计算出数均聚合度为35并且计算出重均聚合度为56。

项目成果

期刊论文数量（6）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

ゲノム情報を活用した有用糖質の合成

利用基因组信息合成有用的碳水化合物

DOI：
发表时间：
2019
期刊：
影响因子：
0
作者：
Komatsu Nao;Ishino Yuko;Shirai Rina;Sakata Ken-taro;Tani Motohiro;Maeda Tatsuya;Tanaka Naotaka;Tabuchi Mitsuaki;磯野直人
通讯作者：
磯野直人

Halobacillus halophilus由来GH30_1酵素のグライコシンターゼ化

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