Characterization of a novel bacteria responsible for the arsenite oxidation in the rhizosphere of arsenic hyper-accumulator, Pteris vittata

负责砷超积累菌 Pteris vittata 根际亚砷酸盐氧化的新型细菌的表征

基本信息

批准号：
19K05778
负责人：
宮内啓介
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Tohoku Gakuin University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒ素高蓄積植物であるモエジマシダは、環境中のヒ酸を根から吸収し、亜ヒ酸はヒ酸に酸化してから吸収する。亜ヒ酸酸化細菌Pandoraea sp. NE5株は、モエジマシダ根圏から単離された、亜ヒ酸酸化能を有する細菌である。しかし、そのゲノム配列からは、既知の亜ヒ酸酸化酵素遺伝子であるaioABに相同性をもつORFは見出されなかった。そこで、本菌の亜ヒ酸酸化酵素遺伝子を明らかにするとともに、モエジマシダ根圏での本菌の役割を探ることとした。昨年度までの研究で、NE5株にトランスポゾン（Tn）を導入し、亜ヒ酸酸化能が低下した変異株を24株得ている。そのうち、oxidoreductaseと相同性を示すORF（LOCUS_16990）にTnが挿入された変異株が24株中4株確認され、それぞれ異なる部位に挿入されていたことから、このORFが亜ヒ酸酸化に関わっている可能性が強く示唆された。昨年度に引き続き、相同組換えを用いたこのORFの破壊を試みた。接合伝達を用いて破壊用プラスミド(Km耐性遺伝子及びsacB遺伝子をもつ)を導入した結果、１回目の相同組換え体を得るためのプレーティングにおいて非特異的にコロニーが生じ、選択培地に特異的なコロニー（Km耐性、スクロース感受性）が生じなかった。エレクトロポレーションでプラスミドを導入した結果、選択培地で１回目の組換えが起きた候補株を得ることができたが、２回目の組換え体（Km感受性、スクロース耐性）を得ることができなかった。１回目の組換え体候補株においてプラスミドが挿入されているのか、またその挿入部位を確認する必要がある。LOCUS_16990高発現株についてはプラスミドを作製し、NE5株に導入しているところである。NE5株のゲノム配列については、DDBJに登録したデータを公開し、投稿した。

日本蕨类植物是一种高度积累砷的植物，通过其根从环境中吸收砷，并在吸收之前将亚砷酸盐氧化成砷酸盐。亚砷酸氧化细菌Pandoraea sp. NE5菌株是从日本蕨根际分离得到的具有亚砷酸氧化能力的细菌。然而，基因组序列并未显示任何与已知亚砷酸氧化酶基因aioAB同源的ORF。因此，我们决定阐明该细菌的亚砷酸氧化酶基因，并探讨该细菌在日本蕨根际的作用。在截至去年的研究中，我们将转座子（Tn）导入NE5菌株中，获得了24个亚砷酸盐氧化能力降低的突变菌株。其中，确认了4个突变株，其中Tn插入到与氧化还原酶同源的ORF(LOCUS_16990)中，并且由于各插入位点不同，因此强烈暗示该ORF可能参与亚砷酸盐氧化。是。从去年开始，我们尝试使用同源重组来破坏这个 ORF。通过接合转移导入破坏质粒(含有Km抗性基因和sacB基因)，在第一次平板接种以获得同源重组体时非特异性地产生菌落，并且在选择培养基上没有产生特异性菌落。（Km抗性，蔗糖敏感）产生。通过电穿孔导入质粒的结果是，我们能够获得在选择性培养基中发生第一次重组的候选菌株，但我们无法获得第二次重组（Km敏感、蔗糖抗性）。需要确认第一重组候选菌株和插入位点是否已插入质粒。我们为 LOCUS_16990 高表达菌株创建了一个质粒，并将其引入到 NE5 菌株中。关于NE5株的基因组序列，在DDBJ上登记的数据已经公开发布。