カルシウムポンプとフリッパーゼ；触媒部位から輸送部位への構造変化の伝達機構

钙泵和翻转酶将结构变化从催化位点传递到转运位点的机制

基本信息

批准号：
20K06534
负责人：
大保貴嗣
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Asahikawa Medical College
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

P型ATPaseのCaポンプはATP加水分解に共役したCa輸送を行い、その輸送サイクルはリン酸化中間体（EP）の形成、異性化、加水分解を経由する。このEPの異性化（E1PCa2 → E2P + 2Ca2+）において細胞質領域の構造変化が膜ドメインの輸送部位に伝わり、E1PCa2の輸送部位に閉塞されていたCa2+が内腔へ放出される。膜貫通領域から細胞質に長く伸びたヘリックスM2はAドメインに繋がっている。M2の膜界面領域にあるGly105をAla 置換すると、EP異性化、およびエネルギー共役（Ca2+輸送/ATP加水分解）が阻害されるので、この領域の柔軟性がM2の機能に重要であると考えた。本研究ではエネルギー共役におけるM2膜貫通領域（M2m）の役割を調べるため、G105AとM2mのGly置換のダブル変異を構築し、機能解析を行った。その結果、G105A/V93GのみG105Aの脱共役から救済された。E1PとE2Pの各アナログの原子構造によると、V93はCa2E1PでM6のL793やW794と相互作用し、EP異性化/Ca放出後のE2Pでその相互作用が切断されていることから、エネルギー共役にはこの相互作用切断が重要であると結論した。フリッパーゼは脂質を膜の内側から外側の層へ輸送するP型ATPaseであり、その類似酵素として、ポリアミン輸送ATPaseのATP13Aがある。しかし、輸送基質であるポリアミンの認識機構や輸送サイクルに関する理解は不明であった。そこで本研究では、クライオ電子顕微鏡による構造解析によって、ATP13A2の複数状態の構造を明らかにし、輸送に必須なアミノ酸残基の置換変異体の機能的解析をすることで、その独自な基質認識機構や輸送機構を明らかにした。ATP13A2の遺伝的変異はパーキンソン病に関連しており、この成果はこの疾患の理解に繋がると期待される。

P型ATP酶Ca泵进行与ATP水解耦合的Ca转运，转运循环涉及磷酸化中间体(EP)的形成、异构化和水解。在EP的异构化过程中（E1PCa2 → E2P + 2Ca2+），细胞质区域的结构变化传递到膜域的转运位点，并且在E1PCa2转运位点被阻断的Ca2+被释放到管腔中。螺旋 M2 从跨膜区延伸至细胞质，与 A 结构域相连。由于用 Ala 取代 M2 膜界面区域的 Gly105 会抑制 EP 异构化和能量耦合（Ca2+ 转运/ATP 水解），因此我们认为该区域的灵活性对于 M2 的功能很重要。在本研究中，为了研究M2跨膜区（M2m）在能量耦合中的作用，我们构建了M2m中G105A和Gly取代的双突变体并进行了功能分析。结果，只有G105A/V93G从G105A的解偶联中被拯救出来。根据E1P和E2P每个类似物的原子结构，V93与Ca2E1P中M6的L793和W794相互作用，并且在EP异构化/Ca释放后，这种相互作用在E2P中被破坏，导致能量共轭，得出结论，这种相互作用裂解是重要的。。 Flippase是一种P型ATP酶，将脂质从膜内层转运至外层，其类似酶是ATP13A，一种多胺转运ATP酶。然而，作为运输底物的多胺的识别机制和运输周期仍不清楚。因此，在本研究中，我们将通过冷冻电子显微镜的结构分析来阐明多种状态下的ATP13A2的结构，并对运输必需的氨基酸残基的取代突变体进行功能分析，从而阐明其独特的底物识别机制。澄清。 ATP13A2 的遗传变异与帕金森病有关，这一结果预计将有助于更好地了解这种疾病。