ミトコンドリアDNAポリメラーゼの多様性と進化の全容解明

完整阐明线粒体DNA聚合酶的多样性和进化

基本信息

批准号：
19H03280
负责人：
稲垣祐司
金额：
$ 10.9万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度までに、ツクバモナス類Tsukubamonas globosa、アンキロモナス類Fabomonas sp.、マラウィモナス類Gefionella okellyiとその近縁系統において新奇ミトコンドリア局在DNAポリメラーゼ候補（これまでheMPと呼称）を発見した。さらにツクバモナスおよびマラウィモナスのheMPのN末端アミノ酸配列を緑色蛍光タンパク質（GFP）と融合させ、酵母細胞内で発現させた。その結果酵母細胞内でGFP蛍光がミトコンドリアに局在することが確認された。2021年度には、同様の実験を、マラウィモナス類とディスコバ類に含まれる2種のheMPに対して行った。アピコンプレクサ類とその近縁系統であるクロモポデリッズ類に特異的DNAポリメラーゼであるapiPolAについては、引き続きサルマラリア原虫細胞をもちいたGFPタンパク質発現ベクターの作成を行った（稲垣）。稲垣はチェコ共和国オストラバ大学・Marek Elias博士と共同で、系統的に広範な真核生物を対象にミトコンドリアあるいは葉緑体局在と考えられるDNAポリメラーゼの探索を行った。その結果、これまで報告されていないDNAポリメラーゼをクロララクニオン藻、クリプト藻、ユーグレナ類から発見した。これらの新奇DNAポリメラーゼ配列は、互いに明らかな近縁性はなく、進化的に独立に獲得されたと考えられる。平川（分担）と稲垣は、新たにクロララクニオン藻類で発見された新奇DNAポリメラーゼについて、その細胞内局在をクロララクニオン藻細胞内で確認するためのGFPタンパク質発現ベクターを作成した。また稲垣はクリプト藻特異的な新奇DNAポリメラーゼの細胞内局在を推測するため、GFPタンパク質を珪藻内で発現させるための発現ベクターを作成した。石谷（分担）は有孔虫ミトコンドリアゲノムにおけるDNAポリメラーゼをふくむDNA複製関連タンパク質の探索を行った。

截至去年，我们在球形筑波单胞菌、豆形单胞菌、Malawimonad Gefionella okellyi 和相关菌株中发现了一种新型线粒体定位 DNA 聚合酶候选物（以前称为 heMP）。此外，筑波单胞菌和马拉维单胞菌的heMP的N端氨基酸序列与绿色荧光蛋白（GFP）融合并在酵母细胞中表达。结果，证实了GFP荧光定位于酵母细胞内的线粒体中。 2021 年，对马拉维莫纳斯 (Malawimonas) 和迪斯科巴 (Discoba) 中的两种 heMP 进行了类似的实验。关于apiPolA，一种针对Apicomplexans及其密切相关的Chromopodelids的DNA聚合酶，我们继续使用猴疟疾寄生虫细胞（Inagaki）创建GFP蛋白表达载体。 Inagaki 与捷克俄斯特拉发大学的 Marek Elias 博士合作寻找 DNA 聚合酶，这些酶被认为位于多种真核生物的线粒体或叶绿体中。结果，在绿蛛植物、隐植物和类眼虫中发现了一种以前未报道过的 DNA 聚合酶。这些新的DNA聚合酶序列彼此之间没有明显的亲缘关系，并且被认为是独立进化的。 Hirakawa（合著者）和 Inagaki 创建了 GFP 蛋白表达载体，以确认在氯蛛藻细胞中新发现的新型 DNA 聚合酶的细胞内定位。 Inagaki 还创建了一个表达载体来在硅藻中表达 GFP 蛋白，以预测隐藻特有的新型 DNA 聚合酶的细胞内定位。 Ishitani（共同作者）在有孔虫线粒体基因组中寻找 DNA 复制相关蛋白，包括 DNA 聚合酶。