真核生物の転写伸長を制御するトリガー反応の1分子観察

控制真核生物转录延伸的触发反应的单分子观察

基本信息

批准号：
20J23072
负责人：
福本紘大
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-24 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

転写や翻訳の反応では、反応の中核を担うRNAポリメラーゼ・リボソーム等に多くの制御因子が結合した複合体 (超分子) が形成されることで、高度な制御が行われている。このような超分子を試験管内で解析することは有用なアプローチであるが、細胞内の複合体には(おそらく未知因子を含む) 多数の分子の助けによって形成されるものも存在し、試験管内で再構成した既知因子による複合体と細胞内の複合体が異なる可能性がある。昨年度までの研究の経過から、本年度では、超分子のモデルとなる翻訳複合体を、多価の結合手を用いることができるDNAオリガミを用いて精製する系を開発することを目標とした。DNAオリガミを用いた多価精製を実現するためには、DNAオリガミ担体上の結合手の種類を２種類以上に増やし、その2種類の結合手が同時に目標複合体に作用した時だけ結合が安定するよう、比較的弱い結合種を用いることが必要である。そこで、DNAオリガミ上に結合させたGFPやタグペプチドに対する抗体で目的分子を捕らえる系を開発した。その結果、GFPを融合させたリボソームや、リボソームによって翻訳されたタグペプチドがDNAオリガミに特異的に結合することを確認した。また、翻訳途中のリボソームを特異的にDNAオリガミ上に結合させることを目標に、翻訳を途中で停止させるストール配列 (SecM) の検討を行った。その結果、リボソームと新生ペプチドの複合体が安定に保持されることを示した。これらの研究結果は、DNAオリガミ上の複数の抗体を用い、翻訳途中のリボソームを特異的に精製する系を確立するために有用な成果である。本研究を発展させることで、細胞破砕液中の目標複合体をDNAオリガミを用いた多価精製を行う実験系の確立に貢献すると期待される。

转录和翻译反应通过形成复合物（超分子）来高度控制，其中许多调节因子与RNA聚合酶、核糖体等结合，在反应中发挥核心作用。尽管体外分析此类超分子是一种有用的方法，但一些细胞内复合物是在许多分子（可能包括未知因子）的帮助下形成的，并且很难在体外分析它们，并且存在与已知因子重构的复合物的可能性。细胞中的复合物与细胞中的复合物不同。根据我们去年的研究进展，今年的目标是开发一种利用可使用多价键的 DNA 折纸技术纯化翻译复合物的系统，该翻译复合物可作为超分子分子的模型。为了利用DNA折纸实现多价纯化，将DNA折纸载体上的结合手类型增加到两种以上，并且只有当两种类型的结合手同时作用于目标复合物时，结合才稳定。有必要使用相对弱结合的物种来实现这一点。因此，我们开发了一种系统，使用针对 GFP 的抗体和附着在 DNA 折纸上的标签肽来捕获目标分子。结果，我们证实了 GFP 融合的核糖体和核糖体翻译的标签肽与 DNA 折纸特异性结合。此外，为了在 DNA 折纸的翻译过程中特异性结合核糖体，我们研究了中途停止翻译的停顿序列 (SecM)。结果表明核糖体-新生肽复合物得到稳定维持。这些研究结果对于建立一个系统非常有用，该系统可以使用 DNA 折纸上的多种抗体特异性纯化正在进行翻译的核糖体。这项研究的发展预计将有助于建立一个使用 DNA 折纸技术对细胞裂解液中目标复合物进行多价纯化的实验系统。

项目成果

期刊论文数量（5）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Oscillatory movement of a dynein-microtubule complex crosslinked with DNA origami

与 DNA 折纸交联的动力蛋白-微管复合物的振荡运动

DOI：
10.7554/elife.76357
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
7.7
作者：
Abdellatef Shimaa A;Tadakuma Hisashi;Yan Kangmin;Fujiwara Takashi;Fukumoto Kodai;Kondo Yuichi;Takazaki Hiroko;Boudria Rofia;Yasunaga Takuo;Higuchi Hideo;Hirose Keiko
通讯作者：
Hirose Keiko

DNAオリガミを用いたキネシン-1の空間配置が輸送複合体の協調運動に与える影響の解析

利用DNA折纸分析驱动蛋白-1的空间排列对运输复合物协调运动的影响