分泌系インタラクトームによる基底膜コラーゲン極性輸送の解明

使用分泌相互作用组阐明基底膜胶原蛋白极性运输

基本信息

批准号：
20J14688
负责人：
天宅あや
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The University of Tokushima
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-24 至 2022-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20J14688/
关键词：
基底膜 IV型コラーゲン線維芽細胞腸上皮細胞共培養極性輸送

项目摘要

本研究では、上皮シートの基底面を支える細胞外マトリックスである基底膜がどのように形成されるのか？そのメカニズムについて、分子レベルで解明することを目指した。計画当初は上皮細胞におけるIV型コラーゲンの基底側への選択的な輸送のメカニズムについて、輸送関連因子のインタラクトーム解析により明らかにすることを予定していた。しかし昨年度までの検討から、解析に必要なIV型コラーゲン輸送を制御する実験系の確立が困難と判断された。一方、並行して行っていた基底膜形成培養系の検討では、胎児由来線維芽細胞（OUMS-36T-2細胞、以下36T-2細胞）を包埋したI型コラーゲンゲル上にヒト大腸上皮がん由来DLD-1細胞を共培養すると、DLD-1細胞の基底面に基底膜様構造が形成されることを見出した。また本共培養系では主に36T-2細胞がIV型コラーゲンを基底膜へ供給しており、DLD-1細胞からの寄与は極めて少ないことが示された。そこで計画当初の目的から方針転換し、線維芽細胞由来IV型コラーゲンの基底膜での会合機構について明らかにすることを目指した。はじめに蛍光標識したIV型コラーゲンを安定発現する36T-2細胞を樹立し、免疫染色や生細胞イメージングにより36T-2細胞由来IV型コラーゲンの行方を追った。その結果36T-2細胞はDLD-1細胞の基底部近傍でIV型コラーゲンを供給することが明らかとなった。さらに36T-2細胞の細胞運動に関与するアクチン結合タンパク質を発現抑制すると、IV型コラーゲン量が低下した。このことから36T-2細胞の運動性が基底膜中でのIV型コラーゲンの配向に必要であることが示唆された。上述の結果から、基底膜領域でのIV型コラーゲンの会合には上皮細胞基底部近傍での線維芽細胞の運動が必要であることが示された。以上により得られた研究成果は国際誌に投稿し、査読後修正中である。

在这项研究中，我们研究了基底膜（支撑上皮片基底表面的细胞外基质）是如何形成的。我们的目的是在分子水平上阐明这一机制。最初，我们计划通过运输相关因素的相互作用组分析来阐明上皮细胞中IV型胶原选择性基底外侧运输的机制。然而，根据去年进行的研究，确定很难建立一个控制分析所需的 IV 型胶原转运的实验系统。同时，在基底膜形成培养系统的平行研究中，在包埋有胎儿成纤维细胞（OUMS-36T-2细胞，以下简称36T-2细胞）的I型胶原凝胶上生长人结肠上皮，我们发现。当DLD-1细胞与源自DLD-1细胞的DLD-1细胞共培养时，在DLD-1细胞的基底表面形成基底膜样结构。此外，在该共培养系统中，36T-2细胞主要向基底膜供应IV型胶原，而DLD-1细胞的贡献极小。因此，我们改变了原来的计划，旨在阐明成纤维细胞来源的IV型胶原在基底膜中的关联机制。首先，我们建立了稳定表达荧光标记的 IV 型胶原的 36T-2 细胞，并使用免疫染色和活细胞成像追踪了 36T-2 细胞衍生的 IV 型胶原的命运。结果显示，36T-2 细胞在 DLD-1 细胞基部附近提供 IV 型胶原。此外，当36T-2细胞中参与细胞运动的肌动蛋白结合蛋白的表达受到抑制时，IV型胶原蛋白的量减少。这表明 36T-2 细胞的运动对于基底膜中 IV 型胶原的定向是必要的。上述结果表明，上皮细胞基底附近的成纤维细胞运动是基底膜区域IV型胶原缔合所必需的。上述获得的研究成果已提交至国际期刊，目前正在经过同行评审后进行修订。