メタバーコーディング技術による吸虫・巻貝の種多様性解析と病原性吸虫症疫学への応用

吸虫和蜗牛物种多样性分析及其在病原吸虫流行病学中的应用

基本信息

批准号：
20J01329
负责人：
尾針由真
金额：
$ 3.08万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-24 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20J01329/
关键词：
吸虫巻貝メタバーコーディングミトゲノム

项目摘要

本研究課題は、巻貝に寄生した吸虫を網羅的に検出する遺伝子解析手法を確立して、吸虫類感染症流行地に特異的な吸虫および巻貝の多様性モデルを提唱することを目的としている。本研究では、巻貝から検出された吸虫のミトコンドリアゲノム（ミトゲノム）全体を網羅的に増幅および解読することで、複数種の吸虫が感染している場合でも分子学的に種判別可能な手法の開発を目標としている。本年度は、吸虫の幅広い分類群でミトゲノムを増幅可能なロングレンジPCR法開発について、前年度に作成したプライマーにより増幅されなかった領域を増幅可能なプライマー領域を探索した。しかし、試験用に採用した6属6種の吸虫種全てについて増幅が確認できるプライマーを設計できなかった。そこで、鎖置換型DNA合成酵素であるPhi29を用いた吸虫のミトゲノム選択的増幅法の確立を試みた。まずミトゲノム選択的増幅法に必要な吸虫のミトゲノムに相同な短鎖塩基配列を探索し、9領域を対象としたプライマーを設計した。その後、相補鎖配列の関係にあるプライマーを除去し、4つのプライマーを用いてミトゲノム選択的増幅法を行なった結果、対象領域の増幅が確認されたことから、これらのプライマーは吸虫のミトゲノムを増幅可能であると考えられる。また吸虫類感染症流行地と非流行地のモデルとなる地域の選定のため、北海道内における巻貝および魚類における吸虫感染状況調査を行なった。前年度の調査の結果をふまえ、Diplostomum属およびApatemon属を対象として魚類における感染状況調査を行なった結果、北海道内の48地点においてDiplostomum属に、19地点においてApatemon属に感染した魚類が採集され、両吸虫種について、遺伝的に異なる隠蔽種が含まれている可能性が示された。しかし、同所的に生息するモノアラガイを発見することができなかった。

本研究项目的目的是建立一种综合检测寄生蜗牛的吸虫的遗传分析方法，并提出针对吸虫感染流行地区的吸虫和蜗牛的多样性模型。在这项研究中，通过全面扩增和解码在蜗牛中检测到的吸虫的整个线粒体基因组（线粒体基因组），我们将开发一种即使在多个物种的吸虫被感染的情况下也可以对物种进行分子识别的方法。今年，为了开发一种可以扩增多种吸虫分类群中丝裂基因组的长程 PCR 方法，我们寻找了可以扩增前一年创建的引物未扩增区域的引物区域。然而，不可能设计出能够确认测试所采用的所有 6 个属和 6 个吸虫种类的扩增的引物。因此，我们尝试使用 Phi29（一种链置换 DNA 合酶）建立吸虫丝裂基因组的选择性扩增方法。首先，我们寻找与吸虫丝裂基因组同源的短核苷酸序列，这是选择性丝裂基因组扩增所必需的，并设计了针对九个区域的引物。之后，我们去除具有互补链序列的引物，并使用四个引物进行有丝分裂基因组选择性扩增方法，结果确认了目标区域的扩增，因此认为这些引物扩增了吸虫有丝分裂基因组。此外，我们还对北海道的蜗牛和鱼类的吸虫感染状况进行了调查，以选择可以作为吸虫感染流行地区和非流行地区模型的地区。根据去年的调查结果，我们对双口鱼属和无口鱼属鱼类的感染状况进行了调查，结果在北海道的19个地点收集了双口鱼属和双口鱼属感染的鱼类。研究表明，这两种吸虫可能含有遗传上不同的神秘物种。然而，我们未能找到任何同域贻贝。