非凍結結晶を用いた“in crystallo”酵素反応解析

使用未冷冻晶体进行“晶体中”酶反应分析

基本信息

批准号：
20K06530
负责人：
村川武志
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Osaka Medical and Pharmaceutical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20K06530/
关键词：
トパキノン HAG法アミン酸化酵素

项目摘要

本研究は，HAG法（湿度調整と水溶性ポリマーのコーティングを用いたタンパク質結晶マウント法）を発展させ，温度やpHが正確に制御された環境下での結晶内の酵素反応を，X線結晶構造解析および結晶顕微分光により直接的に観察することを目的としている．研究試料として土壌細菌Arthrobacter globiformisに由来した銅アミン酸化酵素 (AGAO)を使用し，本酵素の補酵素であるトパキノン（TPQ）の生合成過程における，前駆体Tyr残基からTPQへの構造変化機構の解明を目指す．補酵素TPQは，酸素および銅イオン存在下で，前駆体Tyr残基から自己触媒的に生成する．このため，まず我々は銅イオン非存在下で，大腸菌内にてAGAOを発現，精製し，本酵素の前駆体（Tyr型）結晶を作成した．得られた結晶を嫌気条件下で銅イオン溶液に浸漬後，SPring-8のビームラインに設置されたHAG装置にマウントした．この結晶への吹付け気流を窒素から酸素（空気）に切り替えることにより，結晶内でのTPQ形成反応を開始した．気流切り替え後，経時的に回折測定を行い反応を追跡したところ，結晶内で最終的にTPQが形成したことを確認できた．回折実験に並行し，ビームラインに設置されたオンライン型結晶顕微分光装置による測定も行った．結晶の厚み，および反応の進行度とTPQに由来する480 nmの吸収に良い相関関係が得られ，回折と分光をリンクさせた測定が可能となった．現在，詳細な解析を行っているが，構造変化についての重要な知見が得られ，我々がこれまでに提案した反応スキームをさらに拡張できた．

这项研究旨在开发hag方法（使用湿度控制和水溶性聚合物的涂层蛋白质晶体安装方法），并在温度和pH值通过X射线晶体结构分析和晶体微光谱镜准确控制的环境中直接观察晶体内的酶反应。我们将源自土壤细菌的球菌球菌衍生而成的铜胺氧化酶（AGAO）作为研究样本，旨在阐明在甲二喹酮（TPQ）的生物合成期间，从前体Tyrue到TPQ的结构变化机制，该enzyme的辅酶。在氧气和铜离子存在下，辅酶TPQ是由前体的Tyr残基产生的。因此，在没有铜离子的情况下，我们首先在大肠杆菌中表达和纯化的Agao来创建该酶的前体（Tyr-Type）晶体。在厌氧条件下，将所得晶体浸入铜离子溶液中，并安装在安装在弹簧-8梁线上的hag设备上。通过将吹气的气流从氮切换到氧气（空气），开始了晶体内的TPQ形成反应。切换气流后，随着时间的推移进行衍射测量以跟踪反应，并确认TPQ最终在晶体内形成。与衍射实验并联，还使用安装在梁线上的在线晶体微光谱计进行了测量。获得了从TPQ衍生的480 nm处的晶体厚度与反应的进展与吸收之间的良好相关性，从而可以测量衍射和链接的光谱法。当前，已经进行了详细的分析，并获得了对结构变化的重要见解，从而使我们能够进一步扩大到目前为止提出的反应方案。

项目成果

期刊论文数量（11）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Microcrystal preparation for serial femtosecond X-ray crystallography of bacterial copper amine oxidase

细菌铜胺氧化酶连续飞秒X射线晶体学微晶制备

DOI：
10.1107/s2053230x21008967
发表时间：
2021
期刊：
Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications
影响因子：
0
作者：
Murakawa Takeshi;Suzuki Mamoru;Arima Toshi;Sugahara Michihiro;Tanaka Tomoyuki;Tanaka Rie;Iwata So;Nango Eriko;Tono Kensuke;Hayashi Hideyuki;Fukui Kenji;Yano Takato;Tanizawa Katsuyuki;Okajima Toshihide
通讯作者：
Okajima Toshihide

高分解能中性子結晶構造解析に基づく銅含有アミン酸化酵素の触媒機構

基于高分辨率中子晶体结构分析的含铜胺氧化酶催化机制