不凍タンパク質を利用した低温牛胚保存法による牛胚移植の高度化

抗冻蛋白低温牛胚胎保存法在牛胚胎移植中的进展

基本信息

批准号：
20K06370
负责人：
阪谷美樹
金额：
$ 2.25万
依托单位：
National Agriculture and Food Research Organization
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度はこれまでに牛体外受精胚の緩慢凍結融解後の生存性に効果があると認められたIII型不凍タンパク質（AFP） 1.0microG/mL添加区を用いて胚の遺伝子発現を評価し、さらに移植試験を実施した。食肉センター由来卵巣から回収した卵子により作成した体外受精胚盤胞を用い、対照区は通常の凍結保存液にて保存し、AFP区はAFP 1.0microG/mLの培養液にて1h前培養後、AFP 1.0microG/mLを含む凍結液にて保存した。液体窒素内で少なくとも1か月以上保管した胚を試験に供試した。培養液・保存液への血清利用は胚の遺伝子発現異常や産子の過大化を引き起こす可能性があるため、本課題では胚発生培養液、凍結保存液は血清フリーとした。遺伝子発現試験では融解後、38.5℃ 5% CO2 5% O2気相下で 20% FBS, 還元剤 100microM beta-mercaptoethanolを含むM199培養液中にて24ｈ回復培養後の生存胚のみを回収し、qRT-PCRにて各種遺伝子発現（HSPA1A, POU5F1, NANOG, CDX2, IFNT, CASPASE3）を比較した。ストレスマーカーであるHSPA1Aの発現はAFP区で有意に低く、栄養外胚葉マーカーであるCDX2の発現はAFP区で有意に高かったが、他の内部細胞塊マーカーやアポトーシスマーカー遺伝子に差は認められなかった。HSPA1Aの結果からAFP添加区で凍結による障害が軽減される可能性が示唆された。また、移植試験では発情同期化処理した黒毛和種雌牛に対照区2頭，AFP区1頭に対し、それぞれ1個ずつの胚を移植したところ、対照区1頭のみが受胎した。本結果では、例数が少なくAFPの添加による受胎性効果は評価できていない。

今年，我们使用III型抗冻蛋白（AFP）的1.0微型/mL截面评估了胚胎的基因表达，该型蛋白（AFP）在缓慢冷冻牛在体外胚胎的缓慢冻融后，然后进行了移植测试。使用从肉类中心衍生的卵巢收集的卵中使用体外受精的胚泡，并将对照部分存储在正常的冷冻保存溶液中，而AFP部分则预培养在1.0 microG/ml AFP的培养基中，然后存储在含有1.0微米/mL AFP的Frozen溶液中。测试了在液氮中储存至少一个月的胚胎。在培养和储存溶液中使用血清可能会导致胚胎基因表达和大量出生的异常，因此在这个主题中，胚胎发生培养和冷冻保存溶液不含血清。在基因表达测试中，仅在M199培养基中恢复24小时后，含有20％FBS和100 micromβ-马cer乙醇的M199培养基，在38.5°C，5％FBS的5％CO2 5％O2气相熔化后，降低了100 microm beta-mercapto-mercaptoEthoTo ers n ssp ernol genol gene fections and n ssp e夫（pp），ppecy cletime gene gene gene and n sp collecta cletime gene and n ssp erse fecta collections and beta-mercapto ers exe。通过QRT-PCR比较CDX2，IFNT，caspase3）。在AFP组中，应力标记HSPA1A的表达显着较低，AFP组的滋养外胚层标记CDX2的表达明显更高，但在其他内部细胞质量标记或凋亡标记基因中未观察到差异。 HSPA1A结果表明，在AFP添加的细分市场中，冻结造成的损害可能会减少。此外，在移植试验中，将一个胚胎植入了两个对照部分，一个AFP部分植入了日本黑牛，这些胚胎经受了雌激素的同步，一个对照部分被一个胚胎植入。在此结果中，很少有病例，无法评估增加AFP的生育作用。