真核生物のリボソーム合成制御の新規機構：ラパマイシン結合タンパク質の真の役割

控制真核生物核糖体合成的新机制：雷帕霉素结合蛋白的真正作用

基本信息

批准号：
20K05965
负责人：
笠原浩司
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

・出芽酵母のRPGリボソームタンパク質遺伝子(以下RPG:ribosomal protein gene)の転写因子であるRap1、Fhl1、Hmo1、Ifh1、Sfp1、Fpr1、Crf1について、機能的・物理的相互作用を明らかにするべく遺伝学的解析を行った。その結果、FHL1遺伝子の破壊やCrf1過剰発現、何らかの因子のプリオン化、等の状況で、IFH1破壊株の致死性が回避されるなど、不明な点が多いそれらの因子の機能に関する手がかりが得られた。・生育が極めて悪いfpr1Δfhl1Δ二重破壊株に、Met1を除く全ての残基をアラニン（元がアラニンの場合グリシン）に置換したFpr1変異体シリーズを導入し、この株の生育を回復させる事が出来ない変異体のうち、タンパク質自身は安定なものを12個同定した。・上記RPG転写因子の全長を、N末端にGSTタグ、C末端にHisタグを融合して大腸菌で発現させるためのプラスミドを構築し、発現を行った。その結果、Ifh1を除く全てのタンパク質を、その量には差はあるものの、全長として発現することに成功した。・病原性酵母カンジダ・グラブラータの上記RPG転写因子のオルソログについて、ChIP-seq解析により全ゲノム上の標的遺伝子を網羅的に同定した。その結果、これらの因子は本酵母においても様々な組み合わせでRPG遺伝子プロモーターに結合していることを明らかにした（Sfp1は結合が見られず）。さらに本酵母で独自にRPGの転写に関与する因子を新たに同定し、それについても標的遺伝子の同定に成功した。・上記両酵母で保存されているFpr1/FKBP12の転写因子としての機能がヒトでも保存されているのかを検証するべく、HEK293細胞のFKBP12遺伝子に対してゲノム編集を行うことでそのノックアウト細胞、及びC末端領域に免沈用のタグを組み込んだ細胞を樹立した。

- 进行遗传分析以阐明RAP1，FHL1，HMO1，IFH1，SFP1，FPR1和CRF1的功能和物理相互作用，RPG核糖体蛋白基因的转录因子（以下称为RPG：RPG：核糖体蛋白基因基因）在芽芽中。结果，已经获得了有关这些因素的功能的线索，这些因素通常是未知的，例如IFH1的致命性破坏菌株被避免在诸如FHL1基因的破坏之类的情况下，CRF1过表达，prionsation，某种因素的prionation crf1 exters crf1fpr1Δfhl1Δdoughtectionsan san的介绍，这些因素是造成的。（甘氨酸如果原始是丙氨酸），而无法恢复该菌株生长的突变体中有12个被鉴定为稳定的蛋白质本身。 - 构建质粒，通过与N端的GST标签融合和在C末端的标签来表达大肠杆菌中RPG转录因子的整个长度。结果，尽管其量存在差异，但我们能够成功地表达所有蛋白质除外。 - 通过CHIP-SEQ分析，全面鉴定了致病性酵母念珠菌的上述RPG转录因子的直系同源物。结果，可以发现这些因素在该酵母中的各种组合中也与RPG基因启动子结合（在SFP1中未发现结合）。此外，酵母是针对RPG转录涉及的新个个人因素的新鉴定的，并且也成功鉴定了靶基因。 - 为了验证在两种酵母中作为转录因子保守的FPR1/FKBP12的功能是否在人类中也是保守的，在HEK293细胞的FKBP12基因上进行了基因组编辑，并且在基因敲除细胞和C-末端区域中建立了具有免疫标签的细胞。