新規過剰発現ライブラリを用いた酵母のタンパク質分泌過程におけるボトルネックの解明

使用新型过表达文库阐明酵母蛋白分泌过程中的瓶颈

基本信息

批准号：
20K05229
负责人：
伊藤洋一郎
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、独自に開発した過剰発現ライブラリを活用し、分泌生産性が異なる複数の外来タンパク質を用いて、それぞれの分泌生産に対して律速となっている因子をピキア酵母株より探索、比較することで、酵母の外来タンパク質分泌発現過程におけるボトルネックの解明を目指す。そのために、本年度では下記を行った。１．過剰発現ライブラリの質の評価：次世代シーケンサーを用いて、過剰発現ライブラリを、DNA断片レベル、プラスミドレベル、酵母ゲノムレベルにて評価した。外注で作製した一本鎖DNA配列に挿入・欠損変異が多くみられたものの、どのレベルにおいても過剰発現ライブラリとして機能することが確認できた。２．ピキア酵母株過剰発現ライブラリからのスクリーニング：人工的に設計されたscFv抗体の分泌発現株より、15個以上のscFv抗体分泌発現性が増加した株がスクリーニングにより得られた。それぞれの株の過剰発現した遺伝子を同定し、同遺伝子を過剰発現させたscFv分泌発現株を新たに作製した。そのscFv抗体生産性を評価した結果、10個以上の新規過剰発現型有用因子（過剰発現により外来タンパク質の分泌生産性を増加させるピキア酵母遺伝子）を得ることに成功した。この成功により、本過剰発現ライブラリが機能したことを実証できた。またピキア酵母にて難分泌生産性を示す外来タンパク質の生産株の過剰発現ライブラリを作製しスクリーニングを始めた。異なる外来タンパク質生産株においても、複数の過剰発現型有用因子が得られた。

在本研究中，我们将利用自主开发的过表达文库，使用多种不同分泌能力的外源蛋白来寻找和比较毕赤酵母菌株分泌能力的限制因素，旨在阐明其分泌能力的瓶颈。酵母中外源蛋白的分泌和表达过程。为此，今年我们做了以下工作。 1.过表达文库质量评价：使用二代测序仪对过表达文库在DNA片段水平、质粒水平、酵母基因组水平进行评价。尽管在外包产生的单链DNA序列中观察到许多插入和缺失突变，但我们能够确认它在任何水平上都具有过表达文库的功能。 2.毕赤酵母菌株过表达文库的筛选：从人工设计的scFv抗体分泌表达菌株中筛选得到15种以上scFv抗体分泌表达增加的菌株。鉴定了每个菌株的过表达基因，并创建了新的 scFv 分泌菌株，其中相同的基因被过表达。通过评估scFv抗体生产力，我们成功获得了10多个新的过表达有用因子（其过表达提高了外源蛋白质的分泌生产力的毕赤酵母基因）。这一成功证明了这个过度表达库是有效的。我们还创建了毕赤酵母的过表达文库，该文库产生的外源蛋白的分泌能力较差，并开始筛选。在不同的外源蛋白生产菌株中也获得了多种过表达的有用因子。