マウス原腸胚の三胚葉形成において遺伝子発現を制御するクロマチン構造変化の解明

阐明小鼠原肠胚三个胚层形成过程中控制基因表达的染色质结构变化

基本信息

批准号：
20J21746
负责人：
鈴木颯
金额：
$ 1.98万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-24 至 2023-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、マウス原腸胚における三胚葉形成について、クロマチン構造という観点から内胚葉、外胚葉、中胚葉それぞれで特異的なオープンクロマチン領域を同定することを目的とし、3つの課題に取り組んでいる。以下に令和4年度の研究実施状況を示す。１．三胚葉形成において各胚葉で特異的なオープンクロマチン領域の探索：前年度に引き続き、各々の胚葉を蛍光で識別可能なMIERUマウス(内胚葉マーカーSox17遺伝子にEGFP遺伝子が、外胚葉マーカーOtx2遺伝子にtdTomato遺伝子が、中胚葉マーカーT遺伝子にTagBFP遺伝子がそれぞれノックインされている）ES細胞から三胚葉可視化キメラマウス原腸胚を作製・発達させ、FACSにて胚葉特異的な細胞集団を分取した。上記で分取した細胞に対して、ATAC-seqのライブラリー作製の条件を検討した。しかし、ライブラリー作製の成功には至らなかった。２．各胚葉の特異的オープンクロマチン領域と遺伝子発現との相関の解析： 1.と同様に、EGFPタンパク質を利用したFACSにて分取した細胞で、三胚葉それぞれのマーカー遺伝子の発現を調べた。その結果、外胚葉および中胚葉のマーカー遺伝子の発現は内胚葉マーカー遺伝子よりも低い、あるいは発現が見られなかった。３．オープンクロマチン領域の破壊による胚葉形成異常の確認：クロマチン構造の形成に機能するYbx1遺伝子を破壊したマウス原腸胚にてクロマチン構造解析し、野生型と比較することで、各胚葉形成に重要なオープンクロマチン領域を絞り込めると考えた。MIERUマウスES細胞にCRISPR-Cas9を導入してYbx1-KO ES細胞を作製し、2.と同様にキメラ胚の作製・発達させてEGFPタンパク質を利用したFACSにて細胞を分取した。その後、次世代シーケンサーを用いたデータ取得し遺伝子発現を解析した結果、Ybx1のKOが確認できた。

在本研究中，我们的目的是从小鼠原肠胚三个胚层形成的染色质结构的角度来识别内胚层、外胚层和中胚层中特定的开放染色质区域。 2020财年的研究实施状况如下所示。 1.三叶细胞形成过程中每个胚层特有的开放染色质区域的探索：延续前一年，MIERU小鼠（含有内胚层标记Sox17基因、EGFP基因和外胚层标记Otx2基因），其中每个胚层可以通过荧光具有三个胚层可视化的嵌合小鼠原肠胚是由 ES 细胞（其中 tdTomato 基因被敲入，TagBFP 基因被敲入中胚层标记 T 基因）创建和发育的，并且胚层特异性细胞群通过流式细胞仪。检查了上面分选的细胞的 ATAC-seq 文库制备条件。然而，图书馆建设并不成功。 2.每个胚层的特定开放染色质区域与基因表达之间的相关性分析：与1类似，使用EGFP蛋白在通过FACS分选的细胞中检查三个胚层中每一个的标记基因的表达。结果，外胚层和中胚层标记基因的表达低于内胚层标记基因的表达，或者没有观察到表达。 3.确认开放染色质区域破坏导致胚层形成异常：通过分析小鼠原肠胚胚胎中染色质结构，其中在染色质结构形成中发挥作用的Ybx1基因已被破坏，并与野生型进行比较，我们发现开放的染色质区域对于每个胚层的形成都很重要，我们认为我们可以缩小染色质区域的范围。通过将CRISPR-Cas9导入MIERU小鼠ES细胞来创建Ybx1-KO ES细胞，并且以与2.中相同的方式创建和发育嵌合胚胎，并且使用EGFP蛋白通过FACS对细胞进行分选。之后，我们使用下一代测序仪获得数据并分析基因表达，结果确认了 Ybx1 的 KO。

项目成果

期刊论文数量（5）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

三胚葉形成を可視化するトリプルノックインレポーターシステムの開発

开发三重敲入报告系统以可视化三叶细胞形成

DOI：
发表时间：
2022
期刊：
影响因子：
0
作者：
鈴木颯;村田知弥;大徳陽子;濱田優子;谷本陽子;水野聖哉;杉山文博
通讯作者：
杉山文博

A novel creation of reporter mouse model for visualizing germ layer formation

一种新颖的报告小鼠模型，用于可视化胚层形成

DOI：
发表时间：
2021
期刊：
影响因子：
0
作者：
Hayate Suzuki;Tra Thi Huong Dinh;Yoko Daitoku;Kanako Kato;Yoko Tanimoto;Kazuya Murata;Seiya Mizuno;Fumihiro Sugiyama
通讯作者：
Fumihiro Sugiyama

三胚葉形成の評価に有用なES細胞の作製

可用于评估三叶细胞形成的 ES 细胞的产生