植物二次代謝産物の高効率生産に向けた革新的酵母代謝改変技術の開発

开发创新酵母代谢修饰技术，高效生产植物次生代谢产物

• 批准号: 20J15573
• 负责人: 三ツ井 良輔
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Osaka Prefecture University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-24 至 2022-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20J15573/
• 关键词: Saccharomyces cerevisiae; 植物二次代謝産物; 代謝工学; CRISPR-Cas

本研究では、医薬品や香料などの様々な用途があり産業的価値の高い植物二次代謝産物を高生産する組換え酵母を作製するために、グルコースから目的の植物二次代謝産物に至る多段階の代謝反応を改変する手法の開発を目指した。令和3年度は、前年度に検討した手法によるパチョロール生産酵母の作製を検討した。まず、解糖系から異種経路に至る24種類の代謝酵素遺伝子と15種類の異なるプロモーターを網羅的に組み合わせたDNA断片を作製した。そして、前年度に検討した手法により、作製したこれらDNA断片を酵母染色体の多数箇所に挿入することにより、標的代謝酵素の発現量がランダムに改変された多数の組換え酵母株を作製した。代謝改変を複数回行う場合、手法の特性上、代謝改変途中に標的遺伝子発現量が低下する場合があることが確認された。ただし、代謝改変時に、前の代謝改変の標的遺伝子を重複させることにより、遺伝子発現量の低下を抑制できることが示唆された。本研究で作製した組換え酵母においては、代謝改変後にピルビン酸以降の多数の代謝酵素遺伝子（PDC1、ERG10、ERG20など）の発現量が増加した一方、解糖系酵素遺伝子の発現量は増加しておらず、ピルビン酸以降の代謝反応が二次代謝産物生産に大きく寄与する可能性が示唆された。さらに計算シミュレーションにより、パチョロール生産量向上に寄与する複数の破壊候補を推定した。ただし、期間内に実際に破壊株を作製することはできなかった。また、本研究で作製した組換え酵母株を用いて回分培養を実施し、20 g/Lグルコースから25 mg/L-cultureを生産させることに成功した。さらに、流加培養によって同株のパチョロール生産量を2.6倍に増加させることに成功した。本代謝改変法は酵母における多段階の代謝を改変でき、今後、様々な多段階代謝経路の強化や律速経路の探索といった利用が期待できる。

在这项研究中，我们旨在开发一种方法，从葡萄糖到目标植物二级代谢产物的多步代谢反应，以生产重组酵母，以产生高产量的植物二级代谢物，具有各种用途，例如药物和香料，并且具有高昂的工业价值。在2021年，我们使用上一年讨论的方法研究了产生Pacholool的酵母。首先，制备了DNA片段，以全面结合24种代谢酶基因，从糖酵解到具有15个不同启动子的异源途径。然后，通过使用上一年检查的方法，将这些DNA片段插入酵母染色体上的许多位置，产生了大量的重组酵母菌菌株，靶标代谢酶的表达水平随机改变。已经证实，由于该方法的性质多次进行代谢修饰，靶基因的表达水平可能会在代谢修饰过程中降低。但是，有人提出，可以通过重叠代谢改变期间先前代谢改变的靶基因来抑制基因表达水平的降低。在这项研究中产生的重组酵母中，丙酮酸（PDC1，ERG10，ERG20等）在代谢修饰增加后，许多代谢酶基因的表达水平升高，而糖酵解酶基因的表达水平并未增加，这表明丙酮酸后代谢反应可显着贡献下来的生产。此外，通过计算模拟估算了有助于改善Pacholool产生的多个破坏候选者。但是，在此期间实际上无法实际产生破坏性压力。此外，使用本研究中制备的重组酵母菌菌株进行批处理培养，并成功地从20 g/l葡萄糖中生产了25 mg/l培养物。此外，在同一菌株中，通过饲料批量培养增加了Pacholool的2.6倍。这种代谢修饰方法可以修改酵母中的多阶段代谢，并且可以在将来使用，例如增强各种多阶段代谢途径并寻找限速途径。

项目成果

Bioengineering for the industrial production of 2,3-butanediol by the yeast, Saccharomyces cerevisiae

• DOI: 10.1007/s11274-021-03224-x
• 发表时间: 2022-03-01
• 期刊: WORLD JOURNAL OF MICROBIOLOGY & BIOTECHNOLOGY
• 影响因子: 4.1
• 作者: Mitsui, Ryosuke;Yamada, Ryosuke;Ogino, Hiroyasu
• 通讯作者: Ogino, Hiroyasu