植物二次代謝産物の高効率生産に向けた革新的酵母代謝改変技術の開発

开发创新酵母代谢修饰技术，高效生产植物次生代谢产物

• 批准号: 20J15573
• 负责人: 三ツ井 良輔
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Osaka Prefecture University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-24 至 2022-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20J15573/
• 关键词: Saccharomyces cerevisiae; 植物二次代謝産物; 代謝工学; CRISPR-Cas

本研究では、医薬品や香料などの様々な用途があり産業的価値の高い植物二次代謝産物を高生産する組換え酵母を作製するために、グルコースから目的の植物二次代謝産物に至る多段階の代謝反応を改変する手法の開発を目指した。令和3年度は、前年度に検討した手法によるパチョロール生産酵母の作製を検討した。まず、解糖系から異種経路に至る24種類の代謝酵素遺伝子と15種類の異なるプロモーターを網羅的に組み合わせたDNA断片を作製した。そして、前年度に検討した手法により、作製したこれらDNA断片を酵母染色体の多数箇所に挿入することにより、標的代謝酵素の発現量がランダムに改変された多数の組換え酵母株を作製した。代謝改変を複数回行う場合、手法の特性上、代謝改変途中に標的遺伝子発現量が低下する場合があることが確認された。ただし、代謝改変時に、前の代謝改変の標的遺伝子を重複させることにより、遺伝子発現量の低下を抑制できることが示唆された。本研究で作製した組換え酵母においては、代謝改変後にピルビン酸以降の多数の代謝酵素遺伝子（PDC1、ERG10、ERG20など）の発現量が増加した一方、解糖系酵素遺伝子の発現量は増加しておらず、ピルビン酸以降の代謝反応が二次代謝産物生産に大きく寄与する可能性が示唆された。さらに計算シミュレーションにより、パチョロール生産量向上に寄与する複数の破壊候補を推定した。ただし、期間内に実際に破壊株を作製することはできなかった。また、本研究で作製した組換え酵母株を用いて回分培養を実施し、20 g/Lグルコースから25 mg/L-cultureを生産させることに成功した。さらに、流加培養によって同株のパチョロール生産量を2.6倍に増加させることに成功した。本代謝改変法は酵母における多段階の代謝を改変でき、今後、様々な多段階代謝経路の強化や律速経路の探索といった利用が期待できる。

在这项研究中，为了创造出能够大量生产植物次生代谢物的重组酵母，这些次生代谢物具有医药、香料等多种用途，并具有很高的工业价值，我们将进行从葡萄糖到所需植物次生代谢物的多步过程。目的是开发一种改变代谢反应的方法。 2021年度，我们利用前一年研究的方法，对广藿香醇生产酵母的生产进行了调查。首先，他们创建了全面结合从糖酵解到异源途径的 24 个代谢酶基因和 15 个不同启动子的 DNA 片段。通过使用前一年研究的方法将这些DNA片段插入酵母染色体的多个位置，我们创建了大量重组酵母菌株，其中目标代谢酶的表达水平被随机修改。已证实，当进行多次代谢修饰时，由于方法的特性，目标基因表达水平可能会在代谢修饰过程中降低。然而，有人提出，在代谢修饰过程中，通过复制先前代谢修饰的靶基因，可以抑制基因表达水平的降低。在本研究生产的重组酵母中，丙酮酸后的许多代谢酶基因（PDC1、ERG10、ERG20等）的表达量在经过代谢修饰后有所增加，而糖酵解酶基因的表达量也有所增加，这表明丙酮酸后的代谢反应。丙酮酸可能极大地促进次生代谢产物的产生。此外，通过计算模拟，我们估计了多种有助于提高广藿香醇产量的破坏候选者。然而，在此期间不可能真正创造出破坏的菌株。此外，我们使用本研究中创建的重组酵母菌株进行分批培养，并成功地从 20 g/L 葡萄糖中生产出 25 mg/L 的培养物。此外，他们通过补料分批培养，使用同一菌株成功地将广藿香醇的产量提高了2.6倍。这种代谢修饰方法可以修饰酵母中的多步代谢，未来有望用于强化各种多步代谢途径并寻找限速途径。

项目成果

Bioengineering for the industrial production of 2,3-butanediol by the yeast, Saccharomyces cerevisiae

• DOI: 10.1007/s11274-021-03224-x
• 发表时间: 2022-03-01
• 期刊: WORLD JOURNAL OF MICROBIOLOGY & BIOTECHNOLOGY
• 影响因子: 4.1
• 作者: Mitsui, Ryosuke;Yamada, Ryosuke;Ogino, Hiroyasu
• 通讯作者: Ogino, Hiroyasu