直接リプログラミングによるヒト肺細胞分化誘導法の開発

开发通过直接重编程诱导人肺细胞分化的方法

• 批准号: 20J12690
• 负责人: 楠本 竜也
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-24 至 2022-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20J12690/
• 关键词: Ⅱ型肺胞上皮細胞; Ⅰ型肺胞上皮細胞; SFTPC; 肺線維芽細胞; レンチウイルス; 直接リプログラミング

採用者は、肺の発生に重要な転写因子15種を候補とし、レンチウイルスを用いてヒト初代肺線維芽細胞に15因子を導入した。誘導効率の上昇を目的に培地に各種増殖因子等の液性因子を加え、7日間の3次元培養を行った。Ⅱ型肺胞上皮細胞の特異的マーカーであるSP-C遺伝子の発現を検討し、コントロールに対しSP-C mRNAの上昇を認めた。そして、15因子の各種因子の組み合わせの検討から特異的3因子が必須であることを見出した。採用者は、qPCRによる誘導細胞における肺マーカー遺伝子発現解析を行った。結果、Ⅱ型及びI型肺胞上皮細胞のマーカー遺伝子発現の上昇を確認し、特異的3因子の導入により、Ⅱ型及びⅠ型肺胞上皮細胞等が混在するヘテロな細胞集団の誘導に成功している可能性が示唆された。次に、SP-C/EGFPリポーター遺伝子(SP-C発現時にEGFP蛍光を発現するリポーター遺伝子)を導入した初代肺線維芽細胞を作成し、レンチウイルスを用いて特異的3因子を導入した。培地に各種増殖因子等の液性因子を加え、2次元培養に移行した。因子導入1日後にはEGFP蛍光陽性の細胞が出現し、導入3日後には全細胞の約54％がEGFP陽性となった。SP-C発現細胞のセルソーティングを行い、ソーティングしたSP-C発現細胞のqPCRによる遺伝子発現解析を行った。結果、Ⅱ型肺胞上皮細胞のマーカー遺伝子であるSFTPC発現の上昇、I型肺胞上皮細胞のマーカー遺伝子であるE-cadherin発現の上昇、線維芽細胞のマーカー遺伝子であるVimentinの発現の低下を確認した。また、誘導細胞からソーティングしたSP-Cの発現細胞の免疫蛍光染色を行い、proSP-Cの蛋白レベルでの発現を確認した。ここまでの実験から、肺線維芽細胞に特異的3因子を導入することで、Ⅱ型及びI型肺胞上皮細胞の直接誘導に成功している可能性が示唆された。

雇主使用15种对肺发育重要的转录因子作为候选者，并使用慢病毒将15个因素引入了人类原发性肺成纤维细胞中。为了提高诱导效率，将各种液体因子（例如生长因子）添加到培养基中，并进行了3D培养7天。检查了SP-C基因的表达，即II型肺泡上皮细胞的特定标记，并在对照中观察到SP-C mRNA的增加。然后，通过检查15个因素的各种因素的组合，发现三个特定因素至关重要。雇主对诱导细胞中的肺标记基因表达进行了qPCR分析。结果，我们证实了在II型和I型肺泡上皮细胞中标记基因表达的增加，这表明通过引入三个特定因素，可能已成功诱导了含有II型和I型肺泡上皮细胞等异源细胞种群的含量。接下来，产生了原发性肺成纤维细胞，其中引入了SP-C/EGFP报告基因（一种表达EGFP荧光在SP-C表达时表达EGFP荧光的基因），并使用溶管病毒引入了三个特定因素。将各种流体因子（例如生长因子）添加到培养基中，并转移到二维培养物中。引入因子后一天，出现了EGFP荧光的细胞，引入因子后三天，所有细胞中约有54％的细胞为EGFP阳性。对SP-C表达细胞进行分类，并通过对SP-C表达细胞的qPCR进行基因表达分析。结果，我们证实了SFTPC的表达，SFTPC的表达是II型肺泡上皮细胞的标记基因，E-Cadherin的表达增加，E-钙粘着蛋白的表达，一种用于I型肺泡上皮细胞的标记基因，以及降低Vimentin的表达，降低了Vimentin的表达，成纤维细胞的标记基因。另外，对从诱导细胞排序的SP-C表达的细胞进行免疫荧光染色，以确认蛋白质水平上的prosp-C的表达。到目前为止，实验表明，将三个特定因素引入肺成纤维细胞可能导致了II型和I型肺泡上皮细胞的成功直接诱导。