リボソーマルRNA修飾を介した環境応答的な翻訳制御機構の解明

阐明核糖体RNA修饰介导的环境响应翻译控制机制

• 批准号: 20J00947
• 负责人: 石黒 健介
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-24 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20J00947/
• 关键词: RNA修飾; リボソーム; クライオ電子顕微鏡; 翻訳制御; 結晶構造解析

近年、リボソームが環境に応じてダイナミックに組成を変化させ、翻訳や細胞の生育を制御することが示唆されつつある。しかし、その詳細な機構は依然としてほとんど明らかとなっていない。本研究では、申請者が大腸菌で同定した嫌気環境特異的な3つのrRNA修飾による翻訳制御機構の解明を進めた。採択前までの申請者の研究により、これらの修飾は嫌気環境依存的に修飾率が上昇し、リボソームの翻訳能を向上させて細胞の生育に寄与することが示唆されていた。また、前年度までの構造学的および生化学的な解析により、3つの修飾がPTCの構造安定化を通じてペプチド転移反応効率を向上させ、嫌気環境での細胞生育に貢献していることが示唆された。また、RlmPの最小基質として23S rRNAのHelix 89を中心とする100base程度のRNAを特定した。本年度は、RlmPの結晶化による構造解析を中心に進めた。当初通常の環境でapo-RlmPを用いて結晶化スクリーニングを行ったが、タンパク質結晶を得ることはできなかった。そこで、嫌気チャンバー内でholo-RlmPの再構成を行った上で結晶化スクリーニングを行った。その結果、いくつかの条件でタンパク質結晶らしきものを検出することができたが、高解像度の回折像を得ることはできなかった。また、最小基質のRNAを等モル混ぜた条件でも結晶化スクリーニングを行ったが、タンパク質結晶を得ることはできなかった。そこで、Cryo-EMによるRlmPの構造解析を試みた。まず、apo-RlmPについて酵素の基質となるSAMやMeCbl、rRNA最小基質などの添加の有無により幾つか条件を振りgridの作成およびCryo-EMによる試測定を行った。その結果酵素らしき粒子がMicrograph上で確認できたため、現在pickingの条件などの検討を進めている。

近年来，有人提出核糖体根据环境动态改变其组成并控制翻译和细胞生长。然而，详细的机制仍然很大程度上未知。在这项研究中，我们通过申请人在大肠杆菌中鉴定出的厌氧环境特有的三种rRNA修饰来阐明翻译控制机制。申请人在采用之前的研究表明，这些修饰的修饰率以厌氧环境依赖性方式增加，提高了核糖体的翻译能力，并有助于细胞生长。此外，截至前一年进行的结构和生化分析表明，这三种修饰通过 PTC 的结构稳定提高了转肽反应效率，有助于细胞在厌氧环境中生长。我们还鉴定了以 23S rRNA 的螺旋 89 为中心的约 100 个碱基的 RNA 作为 RlmP 的最小底物。今年，我们重点研究了 RlmP 的结晶结构分析。最初，我们在正常环境下使用apo-RlmP进行结晶筛选，但无法获得蛋白质晶体。因此，我们在厌氧室中重构holo-RlmP，然后进行结晶筛选。结果，虽然在某些条件下可以检测到看似蛋白质晶体的物质，但无法获得高分辨率的衍射图像。还在以等摩尔量混合最小底物RNA的条件下进行结晶筛选，但无法获得蛋白质晶体。因此，我们尝试使用冷冻电镜分析 RlmP 的结构。首先，对于 apo-RlmP，我们根据 SAM、MeCbl 和最小 rRNA 底物等酶底物的存在或不存在，在多种条件下创建了网格，并使用 Cryo-EM 进行了试验测量。结果，在显微镜照片上确认了酶样颗粒，目前正在调查采摘条件。

项目成果

Visualization of decoding modulation by tRNA wobble modifications using Cryo-EM microscopy

使用冷冻电镜显微镜观察 tRNA 摆动修饰的解码调制

• 发表时间: 2023
• 作者: 石黒健介