Elucidation of the mechanism of whole eye development and its reproduction in vitro by regulating scaffold environment using pluripotent stem cells

利用多能干细胞调节支架环境阐明全眼发育及其体外繁殖机制

• 批准号: 20H03842
• 负责人: 林 竜平
• 金额: $ 11.32万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20H03842/
• 关键词: 多能性幹細胞; 眼発生; ECM; インテグリン; 分化; オルガノイド; 角膜; YAP; 涙腺; iPS細胞; 細胞分化

本年度においては、これまでに得たYAP/TAZ経路に関する実験結果に基づき、眼オルガノイド発生に及ぼすYAP/TAZ経路の活性化の影響および3次元オルガノイドモデルの作製実験を実施した。ヒト多能性幹細胞より作製した眼オルガノイドを用いてその初期発生機序におけるYAP/TAZ経路の関与について、YAPの免疫染色や遺伝子発現解析等により調べた。その結果、眼オルガノイドコロニーに中央部の大部分ではYAPは核外に存在し、逆に周辺部では核内に存在していた。またコロニーの中央部、中間、周辺部を機械的に分離し、各領域における遺伝子発現を調べたところ、中央部では神経分化マーカーが、周辺部では上皮系マーカーが強く発現していたことから、YAP経路の活性化と神経・上皮分化の関係性が示唆された。また各領域におけるRNA-seqによる網羅的な遺伝子発現解析により、YAP経路の活性化と相関が見られる既知下流遺伝子を選定し、YAP活性化を標識可能なノックインiPS細胞の樹立を開始した。また3次元オルガノイドモデルとして、ヒトiPS細胞から涙腺様オルガノイドを作製可能であることを示した。免疫染色やタイムラプス顕微鏡観察により、本涙腺様オルガノイド形成においては、まず比較的均質なスフェロイドから外部に細胞が突出し（budding)、導管様構造が形成され、その先端がさらに分岐することにより腺房様細胞に分化すると考えられた。さらにこの形成機構について詳細に調べたとこ、転写因子のBARX2が初期buddingに重要であり、そのノックダウンによりオルガノイド形成は著しく抑制されることが明らかとなった。

今年，我们基于迄今为止获得的YAP/TAZ通路的实验结果，进行了实验来研究YAP/TAZ通路激活对眼部类器官发育的影响，并创建了三维类器官模型。使用人类多能干细胞产生的眼类器官，我们通过 YAP 免疫染色和基因表达分析研究了 YAP/TAZ 通路在早期发育机制中的参与。其结果，在眼类器官集落的中央部的大部分中，YAP存在于核外，相反，在周边部，YAP存在于核内。此外，当我们机械分离集落的中央、中部和外周部分并检查每个区域的基因表达时，我们发现神经分化标记物在中央部分强表达，上皮标记物在外周部分强表达提出了 YAP 途径的激活与神经上皮分化之间的关系。此外，通过使用RNA-seq对每个区域进行全面的基因表达分析，我们选择了与YAP途径激活相关的已知下游基因，并开始建立可标记YAP激活的敲入iPS细胞。我们还证明，可以从人类 iPS 细胞创建泪腺样类器官作为 3D 类器官模型。免疫染色和延时显微镜显示，在泪腺样类器官的形成过程中，细胞首先从相对均匀的球体（出芽）向外突出，形成导管样结构，尖端进一步分支形成腺泡样结构人们认为它分化成细胞。对这种形成机制的进一步详细研究表明，转录因子 BARX2 对于早期出芽非常重要，其敲低可显着抑制类器官的形成。

项目成果

眼薬理

眼药理学

• 发表时间: 2021
• 作者: Tsuji Takahiro;Murase Tomoya;Konishi Yoshiyuki;Inatani Masaru;林 竜平
• 通讯作者: 林 竜平

Generation of knockout rabbits with X-linked severe combined immunodeficiency (X-SCID) using CRISPR/Cas9

• DOI: 10.1038/s41598-020-66780-6
• 发表时间: 2020-06-19
• 期刊: SCIENTIFIC REPORTS
• 影响因子: 4.6
• 作者: Hashikawa, Yoshiko;Hayashi, Ryuhei;Nishida, Kohji
• 通讯作者: Nishida, Kohji

多能性幹細胞を用いた眼発生モデルの確立と再生医療への応用

多能干细胞眼发育模型的建立及其在再生医学中的应用

• 发表时间: 2020
• 作者: Igarashi Nozomi;Honjo Megumi;Yamagishi Reiko;Kurano Makoto;Yatomi Yutaka;Igarashi Koji;Kaburaki Toshikatsu;Aihara Makoto;林 竜平
• 通讯作者: 林 竜平

ヒトiPS細胞からの杯細胞を含有する機能的結膜上皮の作製

从人 iPS 细胞中生成含有杯状细胞的功能性结膜上皮

• 发表时间: 2021
• 作者: 能美君人;林 竜平ら
• 通讯作者: 林 竜平ら

Chondroitin Sulfate as a Potential Modulator of the Stem Cell Niche in Cornea.

• DOI: 10.3389/fcell.2020.567358
• 发表时间: 2020
• 期刊: Frontiers in cell and developmental biology
• 影响因子: 5.5
• 作者: Ashworth S;Harrington J;Hammond GM;Bains KK;Koudouna E;Hayes AJ;Ralphs JR;Regini JW;Young RD;Hayashi R;Nishida K;Hughes CE;Quantock AJ
• 通讯作者: Quantock AJ