Construction of Euglena-based biorefinery

眼虫生物精炼厂建设

• 批准号: 20H03119
• 负责人: 中澤 昌美
• 金额: $ 11.73万
• 依托单位: Osaka Metropolitan University (2022-2023)Osaka Prefecture University (2020-2021)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2020
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2020-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20H03119/
• 关键词: バイオリファイナリー; ユーグレナ; 嫌気的呼吸; 発酵; 嫌気的呼吸鎖; バイオ燃料

これまでの代謝解析では、主にRNAiによるノックダウンを実施してきたが、バイオリファイナリーへの活用を視野に入れると、安定的に遺伝子ノックアウトを行うことが望ましい状況であった。そこで、本研究の2年目にあたる本年度に、研究グループへ、ユーグレナを材料として用いたCRISPR/Cas9ベースのノックアウト技術を導入し、株の獲得から解析に向けた研究スキームを構築することとした。その結果、従来ノックダウンによって「高い生存を保ちながら、嫌気状態でワックスエステル以外の代謝産物を生産」することを明らかにしてきたrquA遺伝子をノックアウトした株の獲得に成功した。本ノックアウト株は、ノックダウン株と同様に嫌気状態での高い生存を保ちながら、そのワックスエステル合成量はコントロール株の20％程度にまで低下していた。さらに、嫌気下で分解される貯蔵多糖からワックスエステルへの変換率は10％未満まで低下しており、嫌気下でのワックスエステル以外の代謝産物合成が上昇している株が獲得できた。本株を嫌気培養し、培養上清中の有機酸量を測定したところ、発酵産物のひとつとして乳酸の量が元株の20倍以上に増加していた。しかし、生成された乳酸量は、嫌気下で分解された貯蔵多糖量から換算したモル比で1.5%に満たない量であった。

迄今为止，代谢分析主要涉及基于RNAi的敲除，但考虑到在生物精炼厂中的应用，希望以稳定的方式进行基因敲除。因此，今年，即本研究的第二年，我们决定向课题组引入以裸藻为材料的基于CRISPR/Cas9的基因敲除技术，构建从菌株获取到分析的研究方案。结果，他们成功获得了rquA基因的敲除菌株，此前该菌株已被证明能够在厌氧条件下保持高存活率并产生蜡酯以外的代谢产物。该敲除菌株与敲除菌株一样在厌氧条件下保持了较高的存活率，但合成的蜡酯量减少至对照菌株的20%左右。并且，厌氧条件下分解的贮藏多糖向蜡酯的转化率降低至10%以下，获得了厌氧条件下蜡酯以外的代谢物合成增加的菌株。当对该菌株进行厌氧培养并测量培养物上清液中的有机酸量时，发酵产物之一的乳酸的量增加了原始菌株的20倍以上。然而，根据在厌氧条件下分解的储存多糖的量计算，产生的乳酸量以摩尔比计小于1.5％。

项目成果

ロドキノンを介する嫌気的呼吸鎖と共役した長鎖脂肪酸合成系の解明

阐明与玫瑰醌介导的厌氧呼吸链耦合的长链脂肪酸合成系统

• 发表时间: 2020
• 作者: 中澤昌美;髙橋夢月;乾 博;坂元君年;上田光宏;阪本龍司
• 通讯作者: 阪本龍司

Anaerobic ATP production coupled with fatty acid synthesis in Euglena mitochondria

眼虫线粒体中无氧 ATP 的产生与脂肪酸的合成相结合

• 发表时间: 2020
• 作者: Masami Nakazawa

NADPH‐to‐NADH conversion by mitochondrial transhydrogenase is indispensable for sustaining anaerobic metabolism in Euglena gracilis

线粒体转氢酶将 NADPH 转化为 NADH 对于眼虫维持无氧代谢是必不可少的

• DOI: 10.1002/1873-3468.14221
• 发表时间: 2021
• 期刊: FEBS Letters
• 影响因子: 3.5
• 作者: Kim Min-Sub;Choi Beom-Soon;Ogello Erick Ochieng;Kim Hee-Jin;Hagiwara Atsushi;Lee Jae-Seong;Masami Nakazawa; Mutsuki Takahashi; Ryuta Hayashi; Yuki Matsubara; Yuichiro Kashiyama; Mitsuhiro Ueda; Hiroshi Inui; Tatsuji Sakamoto
• 通讯作者: Masami Nakazawa; Mutsuki Takahashi; Ryuta Hayashi; Yuki Matsubara; Yuichiro Kashiyama; Mitsuhiro Ueda; Hiroshi Inui; Tatsuji Sakamoto

Anaerobic mitochondria in Euglenoids: metabolic and evolutionary aspects of anaerobic mitochondria.

眼虫中的厌氧线粒体：厌氧线粒体的代谢和进化方面。

• 发表时间: 2021
• 作者: Lee Young Hwan;Kang Hye-Min;Kim Min-Sub;Lee Jin-Sol;Wang Minghua;Hagiwara Atsushi;Jeong Chang-Bum;Lee Jae-Seong;前采花 Beno Kiwale Anton Peter Mchuno Alfred 永源奨 渡邊晋生 関谷信人;Masami Nakazawa
• 通讯作者: Masami Nakazawa

ユーグレナワックスエステル合成系におけるミトコンドリア補酵素変換の重要性

眼虫蜡酯合成系统中线粒体辅酶转化的重要性

• 发表时间: 2022
• 作者: 中澤 昌美;髙橋 夢月;柏山祐一郎;乾 博;上田 光宏;阪本 龍司
• 通讯作者: 阪本 龍司